• Santé - Plasmide, Site, Restriction, Enzyme

[Biologie Moléculaire] vecteur

On récupère les bactéries par centrifugation. Puis, on perméabilise la paroi bactérienne par un traitement doux permettant d'obtenir un passage en solution des plasmides qui sont plus légers que l'ADN bactérien. La purification des plasmides peut être ensuite réalisée par chromatographie liquide à haute performance ou ultra-centrifugation en gradient de densité.  [...] L'insertion d'une séquence d'ADN bicaténaire dans un plasmide nécessite un traitement préalable par une enzyme de restriction. On choisit une enzyme qui a un site unique dans la séquence plasmidique. Après action de l'enzyme de restiction, le plasmide circulaire est linéarisé.  [...]

[Biologie Moléculaire] plasmide recombinant et ADN ligase

j'ai un TP de digestion enzymatique et je suis bloquée sur une question concernant la circularisation d'un fragment d'un plasmide (ce dernier a été hydrolysé par l'enzyme de restriction Agel,ensuite incubé avec la klénow en présence de 4 dNTP, ensuite digéré par EcoRV puis son plus grand fragment contenant 2 sites BglII est purifié).  [...] comment recirculariser ton gros fragment pour former un nouveau plasmide. D'un côté tu as une partie du site de restriction AgeI, et de l'autre tu as une partie du site de restriction de EcoRV. Tes bouts sont entiers... (tu n'as pas de sticky ends ) Alors, quelle enzyme catalyse la ligation de deux fragments d'ADN.  [...]

[Génétique] Analyse plasmides recombinants/non recombinants

Alors voilà. On a le plasmide pBSK qui fait 3 kb. Le technicien de laboratoire a dans un premier temps clivé ce plasmide grâce à une enzyme de restriction (EcoRI) au niveau d'un site multiple de clonage situé au niveau de l'opérons lactose puis l'a transféré dans une bactérie d'E.  [...] Concernant ta question du puit 6, je serait presque pret à parier que ce que tu vois est ton plasmide B (donc ta matrice) mise en trop grande quantité. Ca ressemble à du plasmide et comme ni ta pcr dans le puit 5 (tu as parlé d'une erreur de manipulation) ni dans le puit 7 (pourquoi) n'ont fonctionné, je serait tenté de dire qu'aucune de tes PCR n'a marché malheureusement.  [...]

Carte de restriction

Combien de sites de restriction avez-vous besoin dans le plasmide A pour générer les 2 fragments de 3000 et 500 bp avec une seule et unique enzyme de restriction.  [...] Idem avec le plasmide B pour générer les 3 fragments, en supposant qu'on utilise la même enzyme de restriction pour les 2 plasmides Où se situe le site de restriction surnuméraire et à quoi cela correspond-il concernant la mutation.  [...]

[Biologie Moléculaire] electrophorèse en gel d'agarose

Merci pour votre réponse. (je connais mon cours et ca fait longtemps que je cherchais la réponse à ma question). ce que je ne comprenais pas c'est que dans mon énoncé on me parle d'un plasmide et non d'une cellule. on a digéré le plasmide pBR322 par différentes enzymes de restriction.  [...] mais dans ce cas, si je fais agir une enzyme de restriction qui n'a qu'un site de restriction sur le plasmide il faut que la digestion soit complète pour que je n'obtienne que des fragements de même taille et même volume.  [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage avec plasmide

on met les différents fragment dans un plasmide, et c'est là que rentre en jeu les enzymes de restriction, donc quand on dit que le plasmide a un site de restriction BamH1 cela veut dire que c'est cette enzyme BamH1 qui va cliver un bout du fragment du gène.  [...] je crois que je confonds les sites de restriction présent sur le plasmide et les enzymes de restriction que l'on ajoute aux amorces pour faire la PCR.  [...]

[Biologie Moléculaire] Plasmide

Je dispose de deux enzymes de restrictions, une XhoI qui possède deux site de restriction dans la cassette de polyclonage. l'autre enzyme est MluI cependant sur le schema du plasmide je n'ai pas son site de restriction donc je ne sais pas ou elle coupe.  [...] oui tu peux, sous certaines conditions. Il faut un site de restriction dans le vecteur, et un autre dans l'insert (pas au milieu de l'insert). Selon que l'insert est dans un sens ou dans l'autre, tu auras deux fragments différents en taille. Pour l'histoire du plasmide natif j'aurais dit que c'etait le vecteur seul.  [...]

[Biologie Moléculaire] Réactions in cis in trans

J'ai une présentation à faire sur un article scientifique (en anglais évidemment... elle part par gagnante ma présentation ) et on m'y parle à plusieurs reprises de réactions in cis et in trans. Pour replacer le sujet, il s'agit d'une enzyme de restriction de type IIF, qui coupe un plasmide supercoiled possédant 2 site de restriction pour la-dite enzyme.  [...] Oui il doit surement s'agir des éléments trans-régulateurs et des séquences cis-régulatrices, mais quelle est le rapport avec le plasmide et l'enzyme de réstriction, puisque ces élements sont impliqués dans le processus de transcription.  [...]

[Biologie Moléculaire] Contamination d'ARN par de l'ADN

Après votre PCR, procédez à une digestion enzymatique de vos produits par l'enzyme de restriction DpnI. L'intérêt est que cette enzyme coupe un site de 4pb (donc très fréquent) uniquement quand celui ci est methylé. Du coup vous coupez le plasmide qui a été méthylé lors de sa production en bactérie mais pas vos produits PCR.  [...] Je ne pense pas que digérér par DpnI après l'amplification soit utile dans la mesure ou il s'agit d'une RT PCR, possiblement contaminée par de l'ADN génomique, et non de l'amplification d'un ADN venant d'une bactérie. Ceci dit, si tu soupçonnes un problème de DNAse, tu peux prédigérer tes échantillons par une enzyme de restriction (avant de faire la PCR).  [...]

[Génétique] Intégration ADNc

je ne comprends pas pourquoi le fait d'utiliser deux enzymes de restriction lorsque l'on veut insérer un ADNc dans un plasmide permet de contrôler le sens d'intégration de cet ADNc.  [...] Même si tu peux aussi couper ton plasmide avec une ou 2 autres enzymes qui génèrent des extremités cohésives compatibles avec celles de ton insert. C'est-à-dire que tu peux avoir un site de restriction reconnu par une enzyme différente mais une fois la coupure faite, l'extremité genérée est compatible avec celle de ton enzyme.  [...]