• Santé - Plasmide, Séquences, Résistance, Rapporteur

[Biologie Cellulaire] Expression stable: perte du transgène

j'essaie de produire des lignées stables en les transfectant (via liposomes) avec un vecteur plasmidique portant un gène de résistance (sélection au G418) et gène rapporteur (beta galactosidase). Les lignées (293 et CHO) présentent une bonne expression transitoire à 48h, mais quand je passe à la sélection au G418, les 293 meurent en une semaine et pour ce qui est des CHO j'obtiens des clones résistants au G418 (à partir de trois semaines et plus) mais qui n'expriment pas beta gal.  [...] Je précise que j'ai bien linéarisé le plasmide en dehors des séquences résistance et rapporteur avant la transfection. Comme c'est la première fois que je tente ce genre d'expérience, je ne sais trop comment améliorer la chose. intégration du gène de résistance ET du gène rapporteur (puisqu'il semblerait que je le perde). Quelqu'un a-t-il une idée.  [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage avec plasmide

En générale YFG est couplé à un gène rapporteur (qui permet la sélection des plasmides qui intègrent effectivement YFG). C'est souvent un gène de résistance chez les bactéries. Ainsi lorsqu'on place les bactéries qui ont intégré le plasmide dans un milieu avec antibiotique, ce sont celles qui survivent qui on intégré YFG étant couplé audit gène de résistance à l'antibio.  [...] Pas nécessairement de l'ampicilline. Le choix du marqueur de sélection dépend du plasmide que vous utilisez. Le plus courant est que ce plasmide contient un gène de résistance à l'ampicilline. Quand vous transformez votre bactérie avec votre plasmide, ce dernier lui confère la résistance à l'ampicilline.  [...]

[Génétique] Gène inconnu

Enfaite notre prof nous a dit qu'il était possible de prendre le gène qui donne la faculté a Thermus Aquaticus de survivre dans de telle conditions à E.coli seulement si ce gène se trouvait sur un plasmide, après nous cherchons encore et le fait que vous me disiez que Si elle peut résister c'est parce que beaucoup (toutes ) de ses protéines sont capables de fonctionner dans de telles conditions.  [...] En oubliant la thermostabilité, ne serait il pas plus simple de prendre une lignée de bactérie possédant un plasmide codant pour un quelconque rapporteur (résistance à un antibio, Lacz, Luc, etc...). C'est exactement le même projet, sauf que cette fois ci, il est réalisable.  [...]

[Biologie Moléculaire] organisation plasmide

Dans un plasmide expression( rapporteur). il y a un gene de résistance pour le sélectionner, une origine de réplication, un MCS et par exemple le gène lacZ juste apres.  [...] Non il ne faut pas aller chercher trop loin. Si c'est un plasmide RAPPORTEUR, on veut mesurer l'ACTIVITE d'un PROMOTEUR en mesurant indirectement l'expression d'un gène quantifiable comme ß-galactosidase. Dans ce cas la, on a besoin DU PROMOTEUR d'intérêt et c'est lui que l'on clone dans le MCS en AMONT du gène rapporteur.  [...]

[Biologie Moléculaire] Expériences avec le facteur sigmaE

- on cultive des souches MC4100 qui portent un plasmide rapporteur contenant lacZ sous le contrôle d'un promoteur SigmaE dépendant, dans un milieu contenant du lactose à 30°C pour sélectionner les souches LacZ + qui ont bien intégré le plasmide.  [...] Voilà, j'ai l'impression globalement qu'à la fin on extrait les plasmides et on élimine d'office ceux qui contiennent les gènes dont on sait qu'ils sont sous le contrôle de SigmaE (économie d'argent, d'énergie, de temps) pour séquencer uniquement les plasmides qui contiennent les gènes potentiellement inconnus sous le contrôle de SigmaE.  [...]

[Biologie Cellulaire] Stabilité de l'ARNm

Quand tu veux exprimer une protéine dans une cellule, tu peux transfecter les cellules de manière à ce que ton ADN (plasmide le plus souvent) reste longtemps dans ta cellule. c'est la transfection stable. Tu as alors 2 possibilités. soit tu peux intégrer ton gène dans le génome cellulaire par recombinaison homologue, soit tu utilises des plasmides auto-réplicatifs qui ne s'intègreront pas (on appelle ça des épisomes).  [...] Si au contraire, tu n'as pas besoin de garder ton ADN trop longtemps (plutôt utilisé pour étudier des séquences régulatrices et tu mesures la production de ton gène rapporteur qui est en aval sur 24 à 72 h), tu peux faire une transfection transitoire en utilisant des plasmides qui n'ont pas besoin de se répliquer (plasmises non réplicatifs).  [...]

[Biochimie] étude de promoteur

Une manip' envisageable est de faire un test rapporteur dans une lignée cellulaire. Vous clonez votre promoteur ou des morceaux de votre promoteur en amont de la séquence codante d'un gène rapporteur (CAT, Luc). Vous cotransfectez avec un plasmide codant pour votre facteur de transcription.  [...] En général, l'approche d'invalidation de l'élément de réponse d'un facteur de transcription par mutagenèse dirigée se fait après la troncation régulière du promoteur (énoncé brièvement par Piwi. morceaux de promoteurs en amont d'un gène rapporteur). Celle-ci permet de confirmer la position de l'élément de réponse sur le promoteur est pourquoi pas découvrir un nouvel élément de réponse zappé par le programme bioinformatique.  [...]

[Biologie Moléculaire] Transfection et induction

Alors voilà, pour commencer j'envisage de faire des trasfections de HEK 293 par un plasmide codant une protéine parasitaire et conférant un tag HA afin de voir si elle active la voie NF-kB (gràce à un plasmide rapporteur et test luciférase).  [...] Par ailleurs, en bactéries les protéines récombinantes ne subissent pas les modifications post-traductionnelles qui peuvent être nécessaires à leur conformation tridimensionnelle (et/ou leur activité). Je pense que ça peut également jouer sur leur solubilisation, de même que la présence d'un tag pour la purification.   [...]

[Biochimie] recombineering...

cependant, les ressources que nous possédons pour le moment ne me permettent pas d'introduire la séquence du rapporteur au début de l'ARN non traduit, car les mutants disponibles pour l'intégration du gène rapporteur sont limité(nous utilisons des attP-attB), donc je n'ai qu'un exon disponible au milieu de l'ARN.  [...] Par contre l'idée d'utiliser une séquence IRES semble plausible, se système existant bien chez les droso (voir Pubmed. drosophila ires). Tu pourra tester ta construction chez la levure ou autre culture cellulaire avant de te lancer, pour voir si ton rapporteur est bien traduit.  [...]

[Génétique] phenomene de Conjugaison

Tu va donc pouvoir séléctionner ces bactéries dites conjugués sur un milieu contenant de l'am, km ou sm, puisqu'elle présentera toute les résistances ( il est vrai qu'il aurait fallu avoir des précisions sur le facteur F.  [...] Non, la souche réceptrice aura acquis de nouveaux gènes (on l'espère). Ici, visiblement on cherche à savoir si les propriétés production de béta-gal, AmpR et KanaR seront transmises par ce biais, càd si le gènes LacZ, résistance à Amp et résistance à Kana seront transmis durant la conjugaison.  [...]