• Santé - Plasmide, Séquençage, Séquences

Alignement séquence (Bioinformatique)

Dans notre labo, nous avons commencé à faire du séquencage de protéines. Nous recevons les données et nous les alignons avec une séquence de référence dans NCBI pour savoir si notre protéine est bien présente dans notre plasmide. Le séquencage n'est jamais parfait alors, lorsque je fais ces alignement jobtiens pleins de fragment des séquences homologue.  [...] Salut, oui il y a notre protéine que nous avons transfecté dans un plasmide. Nous l'avons verifier par blast avec la sequence de cette protéine de NCBI (reference). Et nous obtenons pleins de petits fragments d'alignement, ce qui est normal puisque lors du séquencage le logiciel fait pleins d'erreurs et donc l'alignement ce fait moins bien, ce qui crée ces fragments.  [...]

Séquençage de l'ADN

Ah je crois que j'ai compris ce que tu veux dire. en gros on accroche la séquence inconnue sur une autre connue (plasmide par exemple) et du coup on peut synthétiser la 1ère amorce complémentaire du plasmide et comme ça le séquençage va se poursuivre dans notre séquence inconnue.  [...] S'il est obtenu par PCR, ou par digestion enzymatique (sauf blunt) par exemple, on sait dans quel sens il sera inséré dans le plasmide. Si on fait du séquençage total (comme WGS par ex), on s'en fout un peu puisqu'il y aura, après reconstitution, des séquences codantes sur les deux brins.  [...]

isolation d'un plasmide

S'assurer que la bactérie ne possède pas de plasmide avant la transformation Et bien en principe, elles ne possèdent pas le plasmide d'intéret (logique). Tout autre plasmide nous est indifférent. Ce que l'on fait en pratique, c'est que l'on verifie après coup que les bactéries que l'on a selectionnées portent bien l'insert d'intéret (digestion de restriction, séquencage).  [...] Tu peux aussi vérifier la présence du plasmide par insertion d'un gene de résistance à un antibiotique (plus rapide que de faire des digestions ou séquençage) quand c'est possible.  [...]

[génétique] Génétique avec les génomes non séquencés

Si tu connais le gène que tu veux muter, tu peux essayer de voir dans les génomes séquencés quel est le degré de conservation de ce gène (si il est elevé, pas de souci...) ou en tout cas les domaines les plus conservés. Dans ce cas, le plus sage serait de dessiner une amorce dans la région la plus conservée, de séquencer de proche en proche jusqu'à la fin de ton gène.  [...] Tu peux recenser toutes les espèces (ou souches) proches de la tienne qui ont déjà été séquencées et tu fais des alignements de séquences pour trouver les régions conservées. A partir de là, designe de primers dans les régions conservées, séquençage des fragments PCR, cloange du gène dans un plasmide, mutégénèse dirigée, tout est possible.  [...]

[Biologie Moléculaire] séquençage ADN

Sinon ta PCR est intégrée dans un plasmide pour le séquencage ou tu séquences directement ton produit de PCR Si elle est dans un plasmide tu peux essayer de séquencer avec Pu et RP (présent dans tous les plasmides classiques d'amplification type TA cloning tel que le pDrive de qiagen) ou avec T7 qui est aussi presque toujours présent.  [...] tu peux choisir celui que tu veux.) Remarque que tu auras aussi les séquences du T7 et du SP6 (tu peux aussi ajouter T3 dans ta panoplie de primer de séquencage, on le trouve dans quelques plasmides.).  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème de séquençage

peut etre peut digérer ton plasmide avec une enzyme de restriction en ciblant un site unique a proximité de la région pseudonoeud et effectuer deux séquencage s indépendants.  [...] EN fait je me suis remis au sequençage car justement c'est les sequences que la société nous envoie qui présente ces problemes de sequence. Mais je ne pense pas qu'ils fassent la moindre optimisation en standard, je vais me renseigner car c'est une bonne idée.  [...]

[Biochimie] Purification post PCR

j'aurais voulu connaitre une methode qui, à l'issue d'une PCR avec TAq permet de purifier les amplifiats obtenus en écartant ceux qui possèderaient d'éventuelles erreurs.   [...] Après, si tu clones ce fragment dans un plasmide, il faudra amplifier individuellement des clones après transformation et vérifier ta séquence par séquençage.  [...]

[Biologie Cellulaire] Problème quantité d'adn plasmidique après extraction

J'aurais voulu vos avis sur la quantité de plasmide recupére qui moi me semble enorme.. ou alors les kits qiagen sont très mauvais.  [...] Sinon nous en routine on fait des exctractions phenol/chlo pour des minipreps (4ml de culture) puis sequencage. Si c'est bon on sequence le plasmide obtenu.  [...]

mini prep ou Qiagen

tu va utiliser un kit de type quiagène quand tu veux avoir un stock propre de plasmide, pour séquençage ou manip ultérieure par exemple.  [...] tu peux faire des miniprep de qualité QIAGEN. en fait QIAGEN fait mini, midi, maxi, méga prep. La seule différence est la pureté de ton DNA. Si tu veux le séquencer ou le transfecter, il vaut mieux utiliser du QIAGEN ou autre marque commerciale. Mais pour de la biochimie normale, une bonne miniprep à la soude suffit.  [...]

[Biologie Moléculaire] PCR colonie et PCR ADN

Le séquençage que j'ai réalisé était sur les produits de ma miniprep. N'y ayant vu aucun insert, j'ai décidé de les vérifier par PCR sur les ADN obtenus suite à la miniprep. Et il n'y avait plus rien.  [...] -Comment la vérification a-t-elle été faite (séquençage) Oligos dans le plasmide de part et d'autre de l'insert. Je séquence le plasmide des deux côtés. Plus d'insert.  [...]