• Santé - Plasmide, Protéine, Intérêt

proteine ou cellule stable ???

Pour les lignées cellulaire, je comprends un lignée stable comme une lignée exprimant stablement une protéine d'intérêt. Il faut mettre en opposition les lignées stables au lignées transitoires. Je m'explique, dans le cas d'expression hétérologue d'une protéine dans une cellule eucaryote on peut soit.  [...] i) transfecter avec un plasmide qui contient le gène d'intérêt, puis effectuer sa manip sur les cellules (dans ce cas, toutes les cellules n'exprimeront pas la protéine, et celles qui le font, élimineront en quelques génération le plasmide).  [...]

[Immunologie] Fixation pour immonofluorescence

Par contre ils restent visibles dans les cellules transfectées avec les plasmides contenant mes gènes d'intérets. J'ai peur que les méthodes de fixations utilisées n'entrainent une relocalisation cellulaire de mes protéines.  [...] Le plasmide vide signifie qu'il n'y a que la GFP. Donc la GFP est exprimée seule, pas en fusion avec la protéine d'intérêt. Cela fournit un contrôle indispensable pour montrer que les conditions utilisées n'affecte pas la localisation de la GFP, et donc prouver qu'une relocalisation éventuelle de la protéine de fusion GFP-X est spécifique de la protéine X.  [...]

[Biochimie] Travaux pratiques de biochimie des systemes integrés urgents

En général juste pour la fluorescence tu transfecte la cellule avec un plasmide contenant la protéine d'interet suivie de la GFP (ou EGFP pour les eucaryotes je pense) Il s'agit d'une construction à faire à l'aide par exemple d'un plasmide EGFP dans lequel tu insères ta séquence d'interet (mais les manips sont longues, il faut compter un mois au moins).  [...] Le protocole de ceci comprend une première PCR pour produire ton gène d'interet à l'aide de primer possédant des extrémités suplémentaires contenant un site de restriction semblables à ceux présents sur ton plasmide EGFP.  [...]

Protéine de fusion recombinante dimérique, besoin d'aide.

- Pour faire une protéine de fusion, est ce qu'il faut mettre le gène codant pour la protéine d'intérêt et celui pour le gène que l'on souhaite fusionner avec celle-ci (par exemple la poly histidine) sur le même plasmide sans les séparer d'un promoteur ou est ce qu'il faut rajouter quelque chose en plus.  [...] - Pour faire une protéine dimérique, comment on peut opérer Je pensais qu'on pouvait par exemple prendre deux plasmides et ajouter à la fin des deux gènes d'intérêt la thioredoxine.  [...]

[Biologie Moléculaire] Technique GST-Pull Down

cette technique permet de fusionner la GST avec une protéine d'intérêt pour par exemple étudier les partenaires protéiques,  [...] Pour cela on clone dans un plasmide l'ADN codant pour la GST et l'ADN codant pour la protéine d'intérêt, de cette sorte les deux protéines sont fusionnées (elles sont accrochées l'une à l'autres).  [...]

[Biologie Moléculaire] Urgent Clonage

Nous avons reçu un nouveau plasmide, je dois y faire exprimer une protéine. L'insert d'interet est exprimé dans un autre plasmide.  [...] La protéine que je veux exprimer doit avoir une GFP et un tag His, ces deux là sont déjà dans le nouveau plasmide, mai puisque je dois synthetiser mes amorces avec un codon stop, comment ces tags peuvent-ils etre lus.  [...]

[Biologie Cellulaire] Transformation levure par PCR

Je travail sur les levure et je souhaite les transformer afin qu'elles expriment ma protéine d'intérêt couplée à une protéine fluorescente. Pour cela j'utilise la technique. PCR based transformation method qui consiste à utiliser un plasmide (pRS306) qui contient la protéine fluo et faire une PCR avec des oligonucléotides codants pour les séquences de mon gènes que je veux marquer.  [...] Je comprend la théorie mais techniquement je ne vois pas du tout comment cela se produit, comment mon plasmide intègre mes séquences codantes Est ce que il faut digérer mon plasmide avant si vous avez des publi ou des revues qui explique ca en détail je vous en serais très reconnaissant.  [...]

[Microbiologie] transformation bactérienne

On transforme avec un plasmide qui contient en général plusieurs gènes. Un gène de résistance pour sélectionner les bactéries transformantes, et un gène d'intérêt (pour l'expression d'une protéine par exemple).  [...] Rien ne nous empêche de transformer une cellule bactérienne avec plusieurs vecteurs, ou d'insérer sur un même vecteur plusieurs gènes d'intérêt. Mais votre question nécessite quelques précisions.  [...]

[Biologie Moléculaire] purif des proteines recombinantes apres coupure au facteur X

Apres passage par la colonne Nickel pour récupérer la protéine recombinante (sachant que la chaperonne fait 50 Kd et ma proteine d'interet fait 25 Kd) comment dois-je procéder (après coupure au facteur X) pour récupérer le maximum de protéine et éliminer tous l'imidazole (l'imidazole est dangereux pour la suite de ma manip).  [...] la carte de mon plasmide est comme suit. une Chaperonne située en 5' (appelée Trigger factor. cela facilite le bon repliement de ma proteine d'interet et augmente d'une facon tres significative la solubilité de la proteine recombinante) suivi d'un His-tag puis du site de coupure du Facteur Xa et à la fin le Multiple cloning site.  [...]

[Biologie Moléculaire] cDNA et TAG quelle relation?

et pour le plasmide pTTQ18 on dit que c'est un plasmide qui ne présente pas de cDNA,et pour ça on peut pas purifié le protéine recombinante qui en résulte par chromatographie d'affinité on utilisons le protéine de fusion issu de la traduction de la sequence TAG. est ce que c'est juste.  [...] - la seconde est une notion de biochimie. Un TAG comme par exemple le TAG histidine est une courte portion d'acides aminés permettant notamment de purifier une protéine produite par génie génétique. Dans ce cas, la séquence en ADN codant pour ce tag est insérée au début du gène d'intérêt dans un plasmide.  [...]