• Santé - Plasmide, Protéine, Expression

[Biologie Moléculaire] différence entre 2 plasmides

Bonnjour à tous, voilà je lis un article en anglais sur une technique pour réprimer le gène PAX3 qui serait à l'origine d'un rhabdomyosarcome (dû à une translocation chromosomique), dans l'article on parle de expression plasmid et reporter plasmid je ne vois pas de quoi il s'agit, quelqu'un pourrait il m'aider merci beaucoup.  [...] Un plasmide d'expression est un plasmide qui une fois entré dans la cellule permet de produire une protéine alors qu'un plasmide reporter est une construction qui va permettre de reporter l'activité de la protéine synthétisée par le plasmide d'expression. Il s'agit le plus souvent d'un promoteur qui répond à la protéine produite qui est donc un facteur de transcription.  [...]

[Biologie Moléculaire] Phosphorylation sur tyrosine => dégradation par protéasome???

Alors en fait cette protéine est bien ubiquitinylé (.) par des complexes qui reconnaissent des sérines phosphorylées sur cette protéine. Pour ce qui est du MG-132 je n'ai pas encore fait le test. sinon pour ce qui est de la compétition d'expression j'ai fait un contrôle de transfection en cotransfectant le plasmide de la protéine X avec le vecteur d'expression vide de la protéine Y et de plus lorsque je cotransfecte le plasmide de ma prot X avec le plasmide de la kinase Y inactive j'ai l'effet inverse c'est à dire une accumulation d'X.  [...] Désolé de continuer sur le hors-sujet mais qu'appelez-vous phosphorylation in vivo Quelles méthodes pour l'évaluer Western sur la protéine cible avec un anticorps dirigé contre un phosphoépitope généré par la kinase Surexpression de la kinase, incubation brève avec P32, immunoprécipitation de la cible, gel SDS-PAGE puis autoradiographie Inversement avec surexpression de la cible,  [...]

Protéine dépendante d'ions pour une oxydation chez E.Coli

Je cherche une protéine ( si possible dont la séquence est déjà clonée dans un plasmide d'expression chez E.Coli ), qui puisse effectuer une oxydation mais seulement en présence d'un certain seuil de concentration en Ions ( Na+, Cl-, Ca2+ etc ).  [...] Merci pour cette réponse, en effet le domaine est très large, c'était déjà à la base pour savoir si ce type de protéine existait ( enzyme surement d'ailleurs oui ), car mes recherches sont restées infructueuses.  [...]

[Biologie Moléculaire] transfection transitoire/stable

l'expression transitoire est due au fait que le plasmide exprime la proteine mais comme ce plasmide ne se replique pas il est perdu au cours des divisions cellulaires.  [...] Enfaite Je commence une manip pour faire un pool de transfectant stable en selectionnant avec de la géneticine et maintenant depuis 7 jours avec la geneticine j'ai enfin perdus tout les non transfectants et je me demandais combien de temps me faudras t-il pour éliminer les transfectant transitoire et me retrouver uniquement avec les transfectant stable sachant que je ne clone pas je veux juste un pool de transfectant stable.   [...]

[Biologie Moléculaire] Transduction/transfection

J'aurais du coup une autre question. la lipofectamine permettant juste l'entrée, il faut que le plasmide en question puisse s'intégrer dans l'ADN de la cellule si on veut une expression permanante. Je sais que la lignée que j'ai, exprimant un canal dans le plasmide pCIneo (promega), exprime de façon permanente cette molécule.  [...] Cependant sur le manuel de Promega il est dit que ce plasmide peut exprimé la protéine d'interet (que l'on aura eu soin d'intégrer) de manière transitoire ou permanente... Si c'est la séquence du plasmide qui permet ou pas son intégration dans l'ADN de la cellule, comment obtenir ces 2 sortes d'expression (transitoire/permanent) Quel facteur supplémentaire entre en jeu.  [...]

Pureté de l'ADN / efficacité d'expression

pour ce qui est de la pureté de ton ADN pour les transfections, si tu tourne autour de 1,6-1,7 c'est vraiment bien. Pour être honnête, moi j'avais une prép de plasmide qui tournait plutôt autour des 1,4-1,5 et mes transfections sur cellules marchaient très bien, y compris le taux d'expression de la protéine qui convenait pour mon type de manip.  [...] Ma pureté est pas mal, mais je me posais juste cette question car je fais de la coexpression de protéines (récepteurs du glutamate) assez grosses et complexes et, mes résultats étant un peu disons étonnants, je cherchais une raison.  [...]

Transfection plasmide gateway et faible expression proteique

J'essaye en ce moment de transfecter un plasmide pDEST40 (construit avec technologie gateway) et j'obtiens une expression proteique vraiment très faible.  [...] Au delà de mes manip, j'aurais quand même voulu savoir pourquoi ce plasmide nous donnes une si faible expression protéique...par curiosité.  [...]

[Microbiologie] transformation bactérienne

On transforme avec un plasmide qui contient en général plusieurs gènes. Un gène de résistance pour sélectionner les bactéries transformantes, et un gène d'intérêt (pour l'expression d'une protéine par exemple).  [...] Rien ne nous empêche de transformer une cellule bactérienne avec plusieurs vecteurs, ou d'insérer sur un même vecteur plusieurs gènes d'intérêt. Mais votre question nécessite quelques précisions.   [...]

[Génétique] Transfection transitoire plasmide/siRNA

Ma question concerne les mécanismes qui se mettent en place après une transfection transitoire d'un plasmide codant pour une protéine ou d'un siRNA. Je m'explique. quand on transfecte un plasmide d'expression codant pour la GFP par ex c'est transitoire cad qu'au bout de 48H la fluorescence commence à disparaître (dilution globale ou par cellule) que se passe-t-il pour la descendance.  [...] - la disparition progressive de la fluorescence est-elle due à la dilution de la population ou à la dégradation du plasmide et de la protéine exprimée. quelle cinétique.  [...]

[Biologie Moléculaire] Immunodétection après production d'une protéine recombinante

Lors d un TP nous avons transformé une souche E coli (rosetta) avec un plasmide recombinant afin de produire et purifier une proteine d interet. L expression du gene de cette proteine est sous la dependance du promoteur T7, et necessite ainsi l arn pol T7.  [...] Les résultats de l'expression puis de la purif ne sont pas toujours très bon avec un HisTag (et en général moins bon qu'avec un autre Tag). Les His sont chargées + et cela peut gêner la structure de la protéine puis sa stabilité. De plus en interagissant avec la protéine il peut ne pas être accessible pour la purification.  [...]