• Santé - Plasmide, Enzymes, Extrémités

[Biologie Moléculaire] Calcul de rendement

On obtient 4 fragments, on désire obtenir un fragment de 704 pb (la moitié 5' du gène), qu'on liera sur un autre plasmide pSK lui aussi coupé par ces deux enzymes (pour avoir les bonnes extrémités). Ce plasmide pCR fait 5484 pb.  [...] Je crois, la concentration initiale de l'ADN plasmique initiale EST juste la concentration initiale du fragment digéré dont tu as besoin, parce que pour un plasmide, il n'existe qu'UN fragment de 784 bp qui est celui que tu cherches (la moitié 5' du gène, oui ).  [...]

plasmide -digestion par enzymes de restriction

On me dit que je dois dessiner un plasmide après sa digestion par Xho I et Nco I (déterminer les extrémités du plasmide) et je suis incapable de le faire parce-que je comprends ce que je dois faire ni quels outils utiliser.  [...] Je suis désolée mais je comprends pas ce que je dois faire... J'ai bien compris que si on coupe un plasmide circulaire via une enzyme de restriction il devient linéaire mais les extrémités c'est quoi.  [...]

[Génétique] Intégration ADNc

Maintenant si tu coupes les deux bouts avec la même enzyme, tu auras des deux côtés les mêmes sites donc ton brin pourra s'insérer dans n'importe quel sens. En coupant avec deux enzymes, on a un site spécifique pour chacun des bouts, on peut donc décider dans quel sens sera intégré le morceau d'ADN dans le plasmide.  [...] Même si tu peux aussi couper ton plasmide avec une ou 2 autres enzymes qui génèrent des extremités cohésives compatibles avec celles de ton insert. C'est-à-dire que tu peux avoir un site de restriction reconnu par une enzyme différente mais une fois la coupure faite, l'extremité genérée est compatible avec celle de ton enzyme.  [...]

[Génétique] Question qui me tracasse beaucoup ( information génétique )

L'ADN recombinant le but est de prendre un gène (ou une version-. allèle) et de le multiplier afin de pouvoir dans un second temps travailler dessus (séquencage par exemple). Donc à l'aide d'enzymes de restrictions qui reconnaisses certains sites (suite de nucléotides) on va couper le plasmide afin d'insérer notre gène.  [...] Il n'y a pas d'incohérence puisque le gène recombinant est obtenu grâce à la même enzyme de restriction que celle qui sert à ouvrir le plasmide. La séquence ADN d'intérêt s'insère donc dans celle du plasmide par complémentarité de ses extrémités avec celles du plasmide.  [...]

[Biochimie] Rechercher sites de restriction

J aimerais savoir si il est possible de trouver un programme dans lequel on copie une sequence d adn et une ou plusieur enzymes et qu on puisse observer la decoupe de l adn au niveau de la structure primaire eventuellement en 3D ou en video.  [...] En revanche, tu peux trouver une bonne vidéo montrant la coupure d'un plasmide par une enzyme de restriction, puis le collage par une DNA ligase des deux extrémités d'un insert dans ce plasmide clivé. http.//www.youtube.com/watchv=aA5fyWJh5S0. Si tu maitrises les logiciels vidéos, tu peux extraire uniquement la coupure par l'enzyme pour ton projet.  [...]

clonage qui ne fonctionne pas ? ratio ?

Voici brievement le protocole, digestion du plasmide par une enzyme qui génere des extrémités cohésives (pacI), puis purification des deux fragments à partir d'un gel d'agarose QIAEXII.  [...] Je n'ai pas essayé de déphosphorylé, cependant, j'essaye actuellement en parallele un clonage qui ne necessite pas de déphosphorylé le plasmide (digestion par deux autres enzymes generant des exttrémités non compatible afin que le vecteur ne se referme pas).  [...]

génie génétique

Bonjour à tous, lorsque l'on veut insérer un fragment de restriction dans un plasmide pour pouvoir produire des clones, si ce fragment a 2 extrémités identique il pourrait se combiner avec extrémité du plasmide dans un sens aussi bien que dans l'autre alors comment grâce à enzyme de restriction peut-on choisir dans quel sens on veut que ce fragment se positionne.  [...] On peut choisir de fabriquer un fragment dont chaque extrémité présente un site de restriction différents ET qui sont aussi sur le plasmide, comme ça le fragment ne pourra s'insérer que dans un sens qui est celui sur le plasmide de clonage. ok.  [...]

[Génétique] clonage orienté ou non

Si le fragment que je désire insérer dans ce plasmide possède également deux extrémités A, il peut alors s'insérer indfféremment dans le plasmide selon deux orientations.  [...] Pour la petite histoire je me suis amusé aussi exactement avec les mêmes enzymes récemment. Du BamHI dans le plasmide et mon insert BglII. Ca marche au poil mais ça n'est pas orienté du coup (on parle d'enzymes compatibles entre elles).  [...]

Enzyme compatible, non compatible

- On dispose de 2 enzymes de restriction compatibles lorsqu'elles produisent des fragments de restriction qui peuvent s'associer par complémentarité des bases si ce sont des extrémité cohésives, mais qu'en est t'il lorsque ce sont des extrémités franches.  [...] Compatible non compatible fait référence aux extrémités obtenus après la coupure. S'il y a complémentarité entre les extrémités alors les enzymes sont dites compatibles.  [...]

[Biologie Moléculaire] Ligation

Du coup...T2 contenant de la ligase, serait le témoin de ligation oui... Mais je ne vois pas en quoi il montre l'efficacité de la ligation, vu qu'avec ou sans ligase des colonies poussent. Tant que le plasmide est dans la bactérie en gros.  [...] Notre plasmide a été digéré par EcoRV, qui génère des extrémités franches. Ces extrémités ne sont pas compatibles avec les extrémités des produits de PCR. Car la Taq pol rajoute un nucléotide (souvent dATP) sur 3'OH des fragments néosynthétisés. Donc pour que ce soit compatible les extrémités du vecteur doivent porter dTTP en 3'OH.  [...]