• Santé - Plasmide, Enzyme, Ouvert

[Biochimie] nucléase

Tu commences par ouvrir ton plasmide avec une enzyme de restriction, tu fais agir ta phosphatase, et tu peux ensuite tranquillement faire ta réaction de ligation entre ton transgène et le plasmide (et ainsi éviter que ton plasmide ne se referme sur lui-même et d'avoir bossé pour rien).  [...] Admettons voilà ton plasmide ouvert par deux enzymes différentes, une bleue une violette. -PROMOTEUR- site Enzyme de restriction 1 (du vide) site Enzyme de restriction 2 - TERMINATEUR-et on rejoint le promoteur puisque le plasmide est circulaire.  [...]

Problème lors de ligation

J'ai un plasmide pcDNA3 contenant un insert qui est situé entre deux sites de restrictions Xho I, je digère ce plasmide avec l'enzyme Xho I puis je fais migrer dans un gel TAE 1% avant de récupérer mon insert et mon plasmide ouvert ( grâce à un kit wizard).  [...] Le deuxième vrai soucis c'est qu'après l'extraction de plasmide (après repiquage des colonies en milieu liquide) je redigère pour vérifier que tout a bien fonctionné et la j'obtiens un smir.  [...]

ADN de séquence inconnue, choix des enzymes de restriction.

Grosso modo, vous avez un fragment d'ADN que vous souhaitez faire rentrer dans un plasmide. Vous ne savez pas comment il a été obtenu, vous ne connaissez pas son état. Pour le faire entrer dans un plasmide, il va vous falloir ouvrir le plasmide en utilisant une enzyme de restriction dont il existe deux types.  [...] Comme vous n'avez aucune idée de la carte de restriction de votre fragment, il est déconseillé de digérer par une enzyme, vous risquez de le casser. En revanche, vous pourrez toujours l'insérer dans un plasmide ouvert avec une enzyme générant une extrémité franche, sous réserve qu'il ait lui même les extrémités franche. Or vous ne savez rien de cela.  [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage en plasmides de grande taille via Sfi I (astuces)

Je vous mets donc en garde contre l'enzyme mung bean que j'accuse d'avoir grignoté mon plasmide ouvert, de façon non spécifique quand j'ai voulu le rendre blunt.  [...] Cependant passer d'un plasmide ouvert de 17kb à quelque chose de refermé avec l'insert de bonne taille -vérif par PCR- mais de 12 kb c'est assez incompréhensible.  [...]

[Biologie Moléculaire] vecteur

j ai une serie 6 enzyme de restriction et on me demande comment faut il preparer le plasmide,par que enzyme de restriction parmi les 6(bsrDIBSALASELECORIBAMHI PSTI),et en fait j aimerai savoir comment voit on quand il y a incompatibilite entre les extremite cohesive d un fragment digéré par une enzyme (dans mon cas c est NDei)et un plasmide ouvert.  [...] L'insertion d'une séquence d'ADN bicaténaire dans un plasmide nécessite un traitement préalable par une enzyme de restriction. On choisit une enzyme qui a un site unique dans la séquence plasmidique. Après action de l'enzyme de restiction, le plasmide circulaire est linéarisé.  [...]

[Biologie Moléculaire] Plasmide et enzymes de restriction

Pour un TP de biologie moléculaire je dois couper un plasmide avec deux enzymes de restriction différentes, je voulais savoir comment (si c'est possible) empêcher le fragment découpé de se recoller à mon plasmide et ensuite comment récupérer mon vecteur ouvert (mes cours ne sont pas clairs du tout).  [...] Et aussi, comment je peux faire pour récupérer mon plasmide après la digestion Je ne comprends pas si je dois passer par une électrophorèse ou une colonne de silice ou aucun des deux.  [...]

[Biologie Moléculaire] Ligation

ça ne me semble pas logique, car le plasmide ouvert ou non, s'il est présent dans la bactérie, permet de résister à l'ampicilline et permet donc aux colonies de se développer dans la boîte. Le gène de résistance de l'ampicilline n'étant pas localisé dans la zone de coupure.  [...] ça ne me semble pas logique, car le plasmide ouvert ou non, s'il est présent dans la bactérie, permet de résister à l'ampicilline et permet donc aux colonies de se développer dans la boîte.  [...]

[Biologie Moléculaire] Probleme de clonage avec pT7Blue

ce qui est important à comprendre aussi c'est la coloration, elle est due à un gène lacZ, dans ton plasmide (regarde bien la structure de ton plasmide, donc du vecteur...). ce gène code pour une enzyme qui va couper un prosuit appelé X GAL avec lequel vous avez dû mettre les cellules en culture, sinon c'est pas possible que tu aies obtenu la coloration.  [...] Nous avons ouvert le plasmide= end conversion reaction puis incubation 22'C 15 min, inactivation de cette reaction a 75'C pendant 5 min. Refroidissement dans la galce 2 min puis centrifugation. A moins que le plasmide soit deja ouvert, c'etait un kit commercial.  [...]

[Microbiologie] Un plasmide ouvert peut-il être fonctionnel?

[Microbiologie] Un plasmide ouvert peut-il être fonctionnel.  [...] On a un plasmide circulaire avec x propriétés, on l'ouvre par digestion à un endroit vierge (sans gène d'intérêt) et on l'insère dans une bactérie. Est-ce que ce plasmide (linéarisé) est encore fonctionnel Personnellement j'imagine qu'un plasmide tronqué ça fait un peu désordre puis bon on a quand même séparé une séquence en deux (toute séquence à un intérêt) en petit 2 je pense également que des exonucléases bactériennes pourraient l'éliminer.  [...]

[Biologie Moléculaire] Difficulté d'interprétation de gel d'électrophorèse

- pour les digérés. la bande en plus peut s'expliquer par le fait la digestion n'a pas été complète et qu'il reste des plasmides à l'état superenroulé.  [...] - pour les non digérés. ça marche pas vraiment car si la bande à 4000 est l'état superenroulé alors il devrait être majoritaire et ça voudrait dire que le plasmide linéaire migre au même endroit que le plasmide circulaire ouvert.  [...]