• Santé - Plasmide, Enzyme, Coupe

microbiologie - CARTE DE RESTRICTION

La somme des tailles des fragments obtenus doit donner la taille du plasmide initial. Si ce n'est pas le cas, il faut penser à des sites qui donnent des fragments différents mais de même taille. Par exemple, si tu obtiens 1 seul fragment dont la taille est la moitié de la taille du plasmide, ça veut dire que l'enzyme a coupé 2 fois pile-poil au milieu (les sites sont à six heures et midi ).  [...] Le résultat de la digestion avec l'enzyme 2 t'indique qu'elle coupe le plasmide 1 fois mais tu ne peux pas placer son site par rapport aux sites E1.  [...]

[Biologie Moléculaire] blunt-end ligation

Je dois réaliser un clonage assez classique. J'ai mon insert amplifié via la Phusion (et les amorces ne comportent pas d'ajouts d'enz de restriction en 5', c'est juste pile le gène d'intéret qui était dans un autre plasmide). J'ai mon vecteur de destination.  [...] .. il a un MCS, et j'ai repéré une enzyme qui coupe en blunt (hinc2). Donc je suppose que je peux linéariser mon plasmide avec cette enzyme.  [...]

[Génétique] electrophorese

Du coup quand on fait migrer un plasmide circulaire, on ne doit pas s'étonner de voir plusieurs bandes apparaitre. Je note que les différents superenroulements sont en quantités discretes donc on ne voit pas un smear mais bien plusieurs bandes.  [...] En général, pour résoudre ces problème on linéarise le plasmide ce qui résoud tous les superenroulements et on n'a plus qu'une seule bande de la taille du plasmide. Si il reste des bandes c'est soit que l'enzyme coupe mal soit qu'il y a du simple brin.  [...]

électrophorèse sur gel d'agarose

J'ai eu un TP de biotechnologie où on a fait une électrophorèse sur gel d'un plasmide purifié non digéré et d'un plasmide purifié dirigé par deux enzymes de restriction.  [...] Ta première enzyme ouvre le plasmide en coupant à un premier endroit. La seconde coupe à un autre site, et produit 2 morceaux de tailles différentes. d'où les 2 bandes.  [...]

PCR et clonage

2- tu ouvres ton plasmide, soit avec une enzyme qui coupe franc, ou alors cohésive (et tu rempli le site avec la Klenow). puis tu clones directement le produit de PCR (qui est bout franc si tu as utilisé une enzyme fidele).  [...] Le plasmide peut intégrer l'insert par recombinaison homologue. Du coup, il se recircularise et est maintenu. La bactérie conserve la résistance conférée par le plasmide. Soit il se recircularise seul (c'est possible). Soit il reste ouvert, il est digéré et la bactérie meurt.  [...]

[Biologie Moléculaire] Plasmide ligature

ce qui m'étonne c'est que tu coupe ton ADN avec une enzyme et ton plasmide avec une autre. Normalement les bouts collants ne peuvent pas se linéariser comme cela.  [...] Maintenant la ligation est peut être réalisée en bout franc et donc ne tient pas compte des digestions qui ne servent qu'a définir l'emplacement. Dés lors on ne pourra pas redigérer le plasmide reformé avec les mêmes enzymes.  [...]

[Biologie Moléculaire] Contamination d'ARN par de l'ADN

Le test que je suis en train de réaliser consiste à extraire les ARN totaux d'une souche et de rajouter à l'extraction une quantité de plasmide précise (je précise que je cherche les ARNm correspondant à la transcription de mon plasmide). Cette quantité de plasmide est soit DNasée soit non DNasée puis une PCR sera réalisée directement sur ARN (sans RT), cela me permettra de jauger l'efficacité de la DNase du moins je l'espère.  [...] Après votre PCR, procédez à une digestion enzymatique de vos produits par l'enzyme de restriction DpnI. L'intérêt est que cette enzyme coupe un site de 4pb (donc très fréquent) uniquement quand celui ci est methylé. Du coup vous coupez le plasmide qui a été méthylé lors de sa production en bactérie mais pas vos produits PCR.  [...]

[Biologie Moléculaire] Réactions in cis in trans

J'ai une présentation à faire sur un article scientifique (en anglais évidemment... elle part par gagnante ma présentation ) et on m'y parle à plusieurs reprises de réactions in cis et in trans. Pour replacer le sujet, il s'agit d'une enzyme de restriction de type IIF, qui coupe un plasmide supercoiled possédant 2 site de restriction pour la-dite enzyme.  [...] Oui il doit surement s'agir des éléments trans-régulateurs et des séquences cis-régulatrices, mais quelle est le rapport avec le plasmide et l'enzyme de réstriction, puisque ces élements sont impliqués dans le processus de transcription.  [...]

génie génétique

Bonjour à tous, lorsque l'on veut insérer un fragment de restriction dans un plasmide pour pouvoir produire des clones, si ce fragment a 2 extrémités identique il pourrait se combiner avec extrémité du plasmide dans un sens aussi bien que dans l'autre alors comment grâce à enzyme de restriction peut-on choisir dans quel sens on veut que ce fragment se positionne.  [...] donc en gros l'enzyme de restriction coupe le plasmide d'un côté et le fragment de restriction d'un coté, les autres cotés sont intacts et les coté coupés s'emboitent.  [...]

[Biologie Moléculaire] Protocole pour une ligature + tranformation ?

A chaque étape, pensez à faire migrer 200/300ng du plasmide pour vous assurer que l'enzyme a coupé. En contrôle on fait migrer la même quantité de plasmide non coupé. A la seconde étape vous pouvez aussi éventuellement ajouter du plasmide non coupé que vous digèrerez avec la seconde enzyme.  [...] Lui aussi devra être linéarisé, ce qui vous permettra d'être certain que votre enzyme coupe. Vous devrez vous fier à ces contrôles pour l'insert.  [...]