• Santé - Plasmide, Coupe, Formes

[Biologie Moléculaire] PB ADN dans le puit d'agarose

Je commence mon 1 er clonage, donc pour faire court j'ai coupé mon vecteur avec une enzyme de restriction ApaI, qui devrait le linéariser.  [...] Après digestion, j'ai fais migrer mon plasmide coupé versus le non coupé et j'obtiens bien les 3 formes du plasmide non coupé, mais par contre mon plasmide coupé avec ApaI est resté dans le puit, j'ai refais la digestion est même chose.  [...]

[Biochimie] Restriction bizarre

Commençons par le début. Lorsque tu purifies un plasmide, tu peux être amené à observer trois formes différentes de cette même molécule, qui migrent à des vitesses différentes. une forme superenroulée, une forme circulaire relâchée (dans laquelle un des brin est coupé), et une forme linéaire, ou les deux brins sont coupés.  [...] Je dirais donc que dans le puits 1 il y a les formes superenroulée (bande du bas) et circulaire relâchée (bande du haut) du plasmide. Avec BgIII il y a 2 coupures vu qu'on observe deux morceaux d'ADN, et avec PvuII il n'y a qu'une coupure et on obtient la forme linéaire du plasmide.  [...]

[Génétique] Electrophorèse d'un plasmide avec 5 bandes

Le plus simple à mon avis, c'est qu'il y ait plusieurs formes plus ou moins sur-enroulées (topoisomères). Pour le confirmer, essaie de regarder s'il ne reste qu'une seule bande après digestion par une enzyme qui ne coupe qu'une fois dans ton plasmide.  [...] Le coup du plasmide simple brin n'est jamais évoqué dans les cours alors qu'il est relativement fréquent d'en sortir lors des preps. Il passe inaperçu lors d'un clonage classique vu que la bactérie va s'empresser de synthétiser le complémentaire. Le problème c'est que cet abruti ne peut pas être coupé par les enzymes de restriction.  [...]

Augmenter la capacité d'1 plasmide??

Ben, c est un cosmide je pense, dans mon cours on me dis qu on peut augmenter la capacité d un plasmide en faisant d abord un clonage avec un ADN genomique puis...puis je comprends plus rien. c est pour augmenter la quantite d ADN a incorporer...plus on met des sites cos plus on peut y inserer des choses.  [...] La différence est très simple. plasmide, 3-4 kb, jusqu'à 7-8 si t'as de la chance, cosmide c'est plus de 40kb, donc tu clones 10 fois plus vite.  [...]

[Biologie Moléculaire] Le plasmide a t'il l'insert?

Ensuite, si ton plasmide est bien coupe, et qu'il est dephosphoryle ben tous les transformants StreptoR auront un insert (plasmide circulaire) vu qu'un plasmide lineaire (sans insert) ne se replique pas dans la bacterie.  [...] De plus ca t'oblige a repurifier le plasmide apres (perte de temps, d'argent et de quantite) ou alors a faire ta ligation sur un plasmide contenant de la phosphatase + du tampon phosphatase -. perte d'efficacite de la ligation. Je ne dis pas que ca ne marche pas, je l'ai souvent fait, mais les rendements sont moindres et si tu dois faire un clonage difficile, ben ca compte.  [...]

[Biologie Moléculaire] Protocole pour une ligature + tranformation ?

A chaque étape, pensez à faire migrer 200/300ng du plasmide pour vous assurer que l'enzyme a coupé. En contrôle on fait migrer la même quantité de plasmide non coupé. A la seconde étape vous pouvez aussi éventuellement ajouter du plasmide non coupé que vous digèrerez avec la seconde enzyme.  [...] Tu transformes et tu sélectionnes avec l'antibiotique dont la résistance est conférée par ton nouveau vecteur. Du coup, si tous tes plasmides étaient linéarisés tu n'auras sélectionné que tes nouveaux plasmides recombinants. Sinon (le plus probable) il faudra faire un petit screen PCR pour les retrouver.  [...]

[Biologie Moléculaire] Quelques questions ??

3-si par exemple on coupe un plasmide par Bamh1 et on insere une sequence d'adn. Comment peut on verifier la presence de ce fragment ajoute dans le plasmide.  [...] Une Enzymes de restriction est une endonucléases d'origine bactérienne capables de cliver l'ADN double brin en des sites spécifiques.   [...]

principe de transformation des levures?

pour ceux qui est du plasmide l'introduction du géne se fait a l'aide d'enzymes de restriction spécifique qui coupe ton plasmide au niveau des séquence souhaiter et tu peux ainsi introduir ton géne.  [...] J'éspére que c'est clair et que c'est se que tu cherches mais mes connaissances en plasmide remonte de la fac alors désolé si c'est pas trop clair.  [...]

PCR et clonage

on veut cloner une séquence dans un plasmide (pGEM3) coupé par 2 enzymes de restriction (enzymes utilisés pour linéariser pGEM3).mais aucun des sites qui entourent la séquence à cloner n'existe dans le site de clonage de PGEM3.  [...] 2- tu ouvres ton plasmide, soit avec une enzyme qui coupe franc, ou alors cohésive (et tu rempli le site avec la Klenow). puis tu clones directement le produit de PCR (qui est bout franc si tu as utilisé une enzyme fidele).  [...]

[Biologie Moléculaire] Calcul de rendement

On obtient 4 fragments, on désire obtenir un fragment de 704 pb (la moitié 5' du gène), qu'on liera sur un autre plasmide pSK lui aussi coupé par ces deux enzymes (pour avoir les bonnes extrémités). Ce plasmide pCR fait 5484 pb.  [...] Je crois, la concentration initiale de l'ADN plasmique initiale EST juste la concentration initiale du fragment digéré dont tu as besoin, parce que pour un plasmide, il n'existe qu'UN fragment de 784 bp qui est celui que tu cherches (la moitié 5' du gène, oui ).  [...]