• Santé - Plasmide, Contrôle, Digestion

Plasmide

Ensuite, je fais une miniprep d'ADN plasmidique. et il ya cette phrase que je ne comprends pas le plasmide est contrôlé par digestion et par PCR.  [...] La PCR ici donne la même information que la digestion enzymatique, ça permets de confirmer que l'insert est bien présent car il est amplifié. Apres on fait migrer sur gel d'agarose pour vérifier la taille de la séquence amplifié et voir si elle correspond bien a celle attendue.  [...]

[Biologie Moléculaire] Ligation

T1 est un contrôle qui permet de voir combien tu obtiens de clones avec ta simple digestion de plasmides. Si tu as des colonies c'est que tu as encore des plasmides qui n'ont pas été digérés pendant cette étape.  [...] En général, on déphosphoryle le plasmide après la digestion et on fait un contrôle de ligation avec ligase et sans insert (mais vous n'avez pas déphosphorylé pendant ton TP si ). Comme ça ça te montre combien tu as de plasmides qui se recircularisent (et donc mal déphosphorylés) et tu en as beaucoup moins sur boîte qu'en T2.  [...]

[Biologie Moléculaire] PB ADN dans le puit d'agarose

Après digestion, j'ai fais migrer mon plasmide coupé versus le non coupé et j'obtiens bien les 3 formes du plasmide non coupé, mais par contre mon plasmide coupé avec ApaI est resté dans le puit, j'ai refais la digestion est même chose.  [...] Alors quoi faire, je ne pense pas que ce soit la quantité d'ADN car j'ai refais le même protocole avec un autre vecteur et cela fonctionne.   [...]

plasmide -digestion par enzymes de restriction

Tu va passer d'une forme circulaire à une forme linéaire après digestion. On te demande donc de trouver les extrémités du plasmide.  [...] Tu digères un plasmide lorsque tu veux modifier ce dernier, y rajouter un fragment ou en retirer un. On passe avant tout par cette étape de digestion. Après tu as un étape de ligation si éventuellement tu veux recirculariser le plasmide après y avoir insérer un fragment entre XhoI et NcoI.  [...]

[Biochimie] Mecanisme de ligation SOS clonage

-controle aprés double digestion et purif sur gel du produit de digestion (sfi1 coupe partiellement) mais puisque c 'est un fragment lineaire je peux pas controler la quzlité de la digestion.  [...] L'avantage par rapport au produit PCR est que la on peut controler la digestion (passage du circulaire au lineaire) chose pas possible avec le produit PCR, donc jusque la j ai cloner avec l'INSERT issue de la double digestion à patir du plasmide,la derniére fois le dosage de cet insert purifié est de 10.2ng/ul.  [...]

calcul dilution plasmide

et dans se protocole le volume final est de 50ul est ce que vous pouvez m aider pour savoir combien de ul de ce plasmide je dois utiliser.  [...] ou carrément reconcentre mon plasmide car sa donne 116ul et le volume final dans le protocole doit etre de 100ul donc c impossible.  [...]

clonage qui ne fonctionne pas ? ratio ?

Mon controle positif lors de la transformation est le plasmide contenant l'insert (non digéré) c'est ce plasmide que j'ai digéré pour isoler l'insert.  [...] Ce n'est pas mon cas car mon controle de transformation est justement le plasmide contenant l'insert (fournit par le collaborareur qui est celui qui a été digéré et purifié sur gel) et les bacteries pousse.  [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage

Vous pouvez utiliser la CIP (Calf Intestine alkaline Phosphatase) pour supprimer les phosphates des extrémités de votre plasmide. Ainsi, durant la ligation il ne pourra pas se refermer sur lui même et seuls pourrons transformer ceux qui n'auront pas été coupés ou ceux qui auront étés recircularisés en intégrant votre insert.  [...] Dés lors, les quantités d'inserts ne sont plus très importantes si votre digestion est totale (à contrôler en transformant avec le plasmide ouvert sans ligation). En général ce que je fais c'est une photo avec un aliquote du plasmide et de l'insert et j'évalue les quantités à utiliser pour avoir autant de l'un que de l'autre.  [...]

[Biochimie] clonage

j'ai digéré mon vecteur et mes deux inserts en double digestion, ligation, transformation de la NM522 et...la première tentative j'en avait une 50aine de clones mais la PCR n'a révelé aucun clone positif mais pour toutes les autres tentatives je n'ai eu aucun clone que se soit sur le clonage proprement dit ( vecteur+ 2 inserts+ligase) que pour les deux autres controle (vecteur+ligase, vecteur seul).  [...] Ceci nous dit quand même quelque chose sous réserve que vous n'ayez pas dephosphorylé vos vecteurs (CIP). Comme le contrôle vecteur + ligase ne pousse pas, c'est que votre double digestion est effective. Du coup le problème se trouverait plutôt dans les inserts.  [...]

Carte de restriction d'un plasmide

bonjour tout le monde. s'il vous plait je vous savoir comment on peut déterminer la taille d'un vecteur et celle d'ADN génomique dans un plasmide recombinant, j'ai trop cherché sur l'internet mais j'ai pas trouvé la réponse précise. merci d'avance.  [...] AInsi je comprend pas du totu leurs placement, par exemple pourquoi Bam H1 ne se trouve t-il pas à 3700 pbde même pour EcoR1 qui ne se trouve pas comme indiqué à 3300 dans le plasmide.  [...]