• Santé - Plasmide, Clonage, Digestion

[Biologie Moléculaire] problemes de digestion de plasmides

[Biologie Moléculaire] problemes de digestion de plasmides.  [...] j'utilise un plasmide pET 28a pour faire un clonage chez coli mais les différente digestion de ce ce plasmide par EcoR1 Hind3 Xba1 Kpn1 incuber plus ou moins longtemps ne me permette pas d obtenir une digestion correcte. quelqu un a déjà eu ce genre de résultats comment y palier comment l'interpréter.  [...]

calcul dilution plasmide

dans le protocole que j ai en nous demande de prendre 5ug du plasmide la concentration de mon plasmide quand je l ai verifier au nanodrop est de 43ng/ul.  [...] ou carrément reconcentre mon plasmide car sa donne 116ul et le volume final dans le protocole doit etre de 100ul donc c impossible.  [...]

[Biochimie] Clonage après purification sur gel

Je dois donc purifier mon plasmide sur gel après digestion (kit M&N et qiagen testé). Quoique je fasse, le clonage est impossible ensuite. J'ai bien sur essayer de le laver (miniElute de qiagen ou précipiation éthanolique). J'ai changé 3 fois de ligases. Alors que mon clonage fonctionne lorsque je ne purifie pas mon vecteur.  [...] J'ai donc essayé de digéré mon plasmide ainsi que ma k7 de résistance (1 enzyme pour le vecteur mais 2 sites différents et 3 pour la k7 de resistance). Ce protocole n'a fonctionné qu'une fois. Depuis j'ai toujours des vecteurs ayant échappés à la quadruple digestion.  [...]

[Génétique] clonage orienté ou non

Par contre, si on réalise un clonage ayant pour but d'exprimer une protéine, l'orientation de notre insert dans le plasmide d'expression sera primordial pour que le couplage transcription/traduction se réalise.  [...] Depuis que je connais cette astuce je n'envisage plus un clonage à partir d'un plasmide sans une étape digestion par DpnI. A connaitre.  [...]

[Biologie Moléculaire] Détection d'une protéine

Sinon pas le choix, faut refaire le clonage. S' il y a encore des sites de restrictions uniques en 3', il est possible d'y cloner une séquence composée de 2 longs oligos hybridés codant pour une étiquette, mais ca ne me semble pas beaucoup plus simple que de recommencer malheureusement.  [...] Pour ma part, je me demande si je n'ai pas que des mauvais oligos parce que j'ai refait 5 fois mon clonage (digestion plasmide, insert, PCR...) et quand je séquence je retrouve tout le temps le même problème. il me manque au moins 20 nucléotides et y en a 4 qui sont apparus (TTGG je crois).  [...]

[Biologie Moléculaire] perte spontanée d'insert lors du clonage

En fait, j'ai fait un clonage. j'ai essayé d'inserer un gène (2,5kb) dans un plasmide (10kb, pCambia 1300), en aval d'un promoteur (qui lui est déjà préalablement inséré dans le même plamide). Mais comme je travail sur un même site (SacI), j'ai réussi (après beaucoup de galère) à avoir une clone positive mais avec mon insert inversé (criblé par pcr et vérifié par digestion).  [...] En fait, je part du plasmide avec l'insert inversé puisque c'est la seule colonie positive que j'ai eu (Etant donné que je suis sur ce clonage depuis plus de 3 mois). Je religue directement après. Evidemment, j'ai eu beaucoup de background.  [...]

clonage qui ne fonctionne pas ? ratio ?

Je n'ai pas essayé de déphosphorylé, cependant, j'essaye actuellement en parallele un clonage qui ne necessite pas de déphosphorylé le plasmide (digestion par deux autres enzymes generant des exttrémités non compatible afin que le vecteur ne se referme pas).  [...] ... Au final tu vas peut-être découvrir que le site de clonage multiple a été modifié pour je ne sais quelle raison et donc que ton clonage est voué à l'échec (situation déjà vue dans tous les labos ou presque). Ne vérifie pas la totalité du plasmide mais au moins la région correspondant à l'insert et SURTOUT les endroits où tu coupes.  [...]

[Biologie Moléculaire] Sous-clonage et taille des fragments

je sollicite votre aide pour résoudre mon problème. Suite à un sous clonage, mon insert d'intérêt (environ 0.42kb) à été intégré dans un vecteur (3.6kb)... soit une taille totale après sous clonage de 4.02Kb. Après test de différentes colonies (9 en tout) et digestion de mes plasmides (double digestion enzymatique. XhoI / NcoI)...le résultat sur gel donne ceci.  [...] Envoie le clone 1 et le clone 2 au séquençage, ça te coutera moins cher que de refaire des essais de digestion et le résultat sera sans ambiguité.  [...]

[Biologie Moléculaire] comment faire une mutation par PCR?

La mutagenèse permet d'obtenir un court segment de séquence comprenant la région mutée. Il faut ensuite remettre cette séquence dans le plasmide d'origine, à la place du petit segment non-muté. Le meilleur moyen de le faire c'est par simple clonage grâce à des enzymes de restriction.  [...] La mutagenèse permet d'obtenir un court segment de séquence comprenant la région mutée. Il faut ensuite remettre cette séquence dans le plasmide d'origine, à la place du segment non-muté. Le meilleur moyen de le faire c'est par simple clonage grâce à des enzymes de restriction.  [...]

[Microbiologie] clonage dans un plasmide p gex d'une séquence de génome de mycoplasma meleagridis

s'il vous plaît aidez moi mon encadreur m'a demandé de poursuivre les travaux de recherche de l'étudiante qui a quitté le labo sans laisser des documents sur les tubes qu'elle a laissé j'ai trouvé BL21 INSERT Mycoplasma meleagridis je ne sais ce que je dois faire à l'étape suivante tout ce que je sais c'est qu'elle a cloné un fragment d'ADN DE MYCOPLASMA MELEAGRIDIS dans la souche Ecoli TOP 10 APRèS BL 21.  [...] On peut quand même dire que la première chose à faire devant des plasmides dont le contenu est vaguement connu, voir douteux, est de les séquencer pour déterminer au nucléotide près ce qu'ils contiennent. En gros, reconstituer la documentation qui vous fait défaut.  [...]