• Santé - Plasmide, Cellule, Tampon

principe de transformation des levures?

je débute un apprentissage de laborantine en biologie et j'ai beucoup de mal, car nous commençons à apprendre le contenu et le fonctionnement d'une cellule en cours alors qu'au boulot c'est un niveau nettement plus élevé.  [...] Si c'est ça le principe est pas trop compliqué,tu introduit un plasmide bactérien modifier compartant le géne que tu veux introduir dans ta cellule qui aurra préalablement était rendu perméable grace à un tampon ( enfin je crois que c un tampon. non).  [...]

[Biologie Cellulaire] HEK et ultracentrifugation

je voudrais faire une ultracentrifugationd différentielle à partir de HEK transfectées avec mon plasmide x. le problème c'est que je n'arrive pas à casser mes cellules. j'ai essayé le potter en verre, le teflon... rien n'y fait. une idée je ne peux pas les soniquer ou utiliser un tampon avec détergent sans compromettre l'ultracentri.  [...]

[Microbiologie] digestion de plasmide

j'ai digéré mon plasmide pbluescript avec ECOR I le problème c'est que je me suis rendue compte après que le tampon OPA seul avec le plasmide sans Enzyme provoque une digestion de ce dernier donc le tampon contient des endonucléases sachant que je ne peux pas jeter le tampon parce que sinon je dois patienter 3 mois pour recevoir la prochaine commande une dilution de tampon serait elle efficace pour se débarrasser des nucléases Même si je sais que ce n'est pas la bonne solution.  [...] J'ai pas très bien compris si ta commande si c était pour du pBluescript ou pour du tampon mais si c'est pour le pBluescript, normalement tu as du sauver ton plasmide dans une souche E. coli, donc tu l'as ressort du congélo et tu refais une miniprep (si tu l'as pas sauvé ben t'attend et la prochaine fois, tu le sauves avant de le restreindre).  [...]

extraire de l'ADN

j'ai trouvé quelque chose à propos de ça mais en anglais et çava perdre beacoup de temps pour que je pourrai comprendre, j'ai quelques information sur l'EDTA c'est qu'il est un chélateur des ions ( il attire certain ions comme le Mg2+ par formation des liaison covalents ) et qu'il est un inhibiteur de nucléase ( je ne comprend ni le mécanisme ni le fonctionnement de cet effet ).   [...] Après pour méthyler in vitro un plasmide par exemple, suffit d'utiliser une bactérie. en insérant le plasmide dans la bactérie, celle-ci va automatiquement le méthyler. Sinon, suffit de mélanger dans un tube du plasmide avec une méthyltransférase, de la SAM, du tampon (perso je n'ai jamais fait l'un ou l'autre donc sa reste théorique, vu que je ne sois pas quelle expériences nécessiterais la méthylation d'un plasmide).  [...]

[Biologie Moléculaire] Plasmide

Ensuite nous déposons les digestions réalisées sur un gel d'electrophorese, puis nous preparons un marqueur de taille et egalement un plasmide natif mais non digéré qui contient 2µL du plasmide, 8µL d'eau stérile et 1µL de tampon de depot.  [...] Puisque tu n'a aucune info sur l'insert, il semblerait logique que le terme natif renvoie au plasmide avec insert (celui que tu as digéré) non digéré. Essaie de faire l'exercice avec ce postulat.  [...]

[Biochimie] Resistance à la zeocine pourquoi ?

En procédant à l'extraction de l'ADN plasmidique pour controler la presence du plamside recombinant, je n'ai trouvé aucun plasmide et ça m'a intrigué comment est ce possible d'ou est ce qu'elles tiennent cette resistance ce sont pas des bactérie satellite a mon avis selon leur taille.  [...] Ce que je veux dire c'est que dans ton échantillon test, tu as des solutions que tu ne contrôles pas. le tampon dans lequel est ton plasmide, le tampon dans lequel tu le dilue, et d'autres comme les tampons pour ligation... en fonction de ton clonage. Ce n'est évidemment qu'une supposition.  [...]

[Biologie Moléculaire] Protocole digestion

Une question. quelle quantité d'ADN plasmidique devrais-je mettre Mon plasmide a une concentration de 150 ng/ul, j'ai fait mon calcul pour le nombre d'unités d'enzyme pour 1 ug d'ADN plasmidique. Est-ce une quantité cohérente (mon clonage ultérieur sera un peu ch****).  [...] L'avantage de la PCR, c'est que tu peux la faire directement sur les clones, sans passer par une étape d'extraction d'ADN. De plus, mais cela dépend de la taille de ton insert, s'il est petit tu peux galérer pour avoir digérer assez d'ADN et le voir (insert de 150 pbs, faut digérer énormément de plasmides pour le voir).  [...]

Carte de restriction d'un plasmide inconnu

Sachant que l'on doit choisir 5 à 6 enzymes. Deja dans un premier temps comment peut on savoir lesquels choisir préférentiellement Est ce que le choix des enzymes auraient juste avoir avec les couples d'enzymes qui ont une bonne activité ensemble pour pouvoir les coupler lors des digestion avec un même tampon Je compte faire mes digestions et analyser sur gel d'électrophorèse d'agarose à 1% (ne connaissant pas du tout la taille du plasmide je suppose qu'il a plus de chance de se trouver entre 10kb et 0.  [...] Ensuite, il n'est pas possible de mélanger toute les enzymes. Soyons fou, et admettons que tu veuille mettre ton plasmide et tes 6 enzymes en même temps. Tu va devoir choisir un tampon de digestion (ph, concentration en sel) unique pour toute tes enzymes. et certaines ne fonctionneront alors pas (enfin, il est possible une astuce, mais pas avec un choix restreint d'Ez).  [...]

[Biologie Moléculaire] difficulté plasmide lentiviral

J'ai un problème de clonage d'un petit oligo (shRNA) dans un vecteur lentiviral qu'il faut digérer AgeI/EcoRI pour le site de clonage. Sauf que mon problème se révèle bien plus basique que cela, après quelques déboires, je viens de me rendre compte que je n'arrive même pas à obtenir des clones après transfo de mon plasmide simplement digéré EcoRI OU AgeI et religué sur lui-même.  [...] .. Le plasmide non digéré se transforme sans problème même si après une nuit à 37°C les clones sont assez petits. Pour info, il est conseillé d'utiliser des bactéries déficientes pour la recombinaison avec ce plasmide, donc j'ai utilisé des SURE2. Je précise aussi qu'après avoir constaté que j'avais un problème basique dans ma ligation, je l'ai refaite avec nouvelle ligase et nouveau tampon de ligase et.  [...]

[Biologie Moléculaire] Selection de bactéries par Antibiotiques lors du clonage d'ADN

*Bref, le contexte est le suivant. on veut cloner un gène de l'ADN humain, pour ceci on utilise les plasmides des bactéries d'E.Coli qui contiennent entre autres des gènes de résistance à la tetracycline et l'ampicilline, grâce aux enzymes de restriction on peut incorporer le gène humain qu'on veut cloner dans le plasmide à un emplacement entre les séquences du gène qui code pour la résistance à la tetracycline.  [...] tu sélectionnes d'abord les transformants sur ampicilline, puis, à l'aide d'un tampon de velours, tu répliques les clones de la boîtes ampi sur une boîte contenant de la tétracycline. Ceux qui poussent ont le plasmide sans le gène d'intérêt. Ceux qui ne poussent pas ont le plasmide, mais leur gène TetR est inactivé et donc le gène est potentiellement inséré dedans.  [...]