• Santé - Migration, Transfert, Membrane, Méthode

[Biochimie] gros loading de protéine pour un western blot

J'utilise un kit invitrogen pour la migration sur gel et un transfert sur membrane selon la méthode Laemli (transfert par diffusion sur 2 membranes).  [...] 60µg c'est vraiment beaucoup. L'expérience montre que si l'on charge trop un gel la migration est pourrie et la détection marche mal. C'est ainsi que parfois, quand on y arrive pas il vaut même mieux diminuer la quantité de protéines chargées plutôt que de l'augmenter.  [...]

[Biologie Moléculaire] Western blot difficile d'une protéine de réparation de l'ADN

Il est aussi question dans l'article de bloquer le gel de migration (, jamais vu ça ) avant le transfert sur membrane de nitrocellulose, qui est également bloquée après le transfert.  [...] Après, il faut également se rendre compte que tu gardes (et fait migrer) également les lipides de la membrane et l'ADN. Ca pollue et peut interagir.  [...]

différence entre western blot et immunoblot

Un western blot est un cas particulier d'immunoblot. Un immunoblot est une technique avec laquelle tu détectes des molécules immobilisées sur une membrane avec des anticorps. Un western blot est un immunoblot dans lequel tu détectes des protéines séparées par électrophorèse.  [...] L'immuno-blot est aussi appelé Dot-Blot, car on dépose les échantillons sur la membrane sous forme de rond (de la taille d'un puits de plaque 96 puits). Cette technique est plus rapide car elle permet d'économiser le temps de la migration et en partie du transfert (le temps de transfert/fixation d'un dot blot est généralement plus court que celle d'un WB).  [...]

Immunoblot

Non. La migration c'est lorsque le sprotéines migrent selon leur masse moléculaire dans le gel. Ensuite le transfert permet de changer ce sprotéines de support. on les passe du gel à une membrane. Le transfert utilise aussi le courant électrique mais ce n'est pas comme la migration.  [...] Le western blot consiste en une migration des protéines dénaturées au beta mercaptoethanol et SDS dans un gel de polyacrylamide+SDS (détergent qui va dénaturer les protéines et les charger), un transfert sur membrane et une révélation grâce à des anticorps marqués.  [...]

[Biologie Cellulaire] Western Blot ATM phosphorylé

J'ai déjà testé de nombreux protocoles sans succès (méthodes d'extraction différentes, migration sur petit/grand gel, transfert liquide/semi-sec..), donc j'aimerais savoir si quelqu'un possède un protocole précis ou des indications.  [...] Et, ATM est une grosse protéine, très peu abondante. Y a t-il une méthode d'extraction à privilégier de migration et de transfert.  [...]

[Biochimie] Extraction protéique au laemmli ?

J'ai une petite question sur une manip que je fais en ce moment. J'étudie une protéine sur laquelle j'ai fait quelques délétions pour caractériser un peu mieux ces fonctions. J'ai transfecté les plasmides dans des HeLa, extraction des protéines au RIPA, migration et WB.  [...] Après migration et transfert sur membrane, la coloration en ponceau est ignoble et le western est très moche.  [...]

[Biochimie] migration sds page

Après la migration, je fais un transfert et je vérifie ensuite par du rouge ponceau la qualité de la migration et du transfert. Ensuite je fais une marquage anticorps. Le problème est donc que je ne fais pas de photo au ponceau, je le rince direct et je sature ma membrane pour la révélation.  [...] Je commence par vérifier la qualité du transfert par une coloration rouge ponceau, et c'est là que je me rends compte de la qualité de la migration de mes protéines. Après le rouge ponceau je rince la membrane dans du PBS et je fais une immunorévélation de ma (mes) protéines d'intérêts.  [...]

[Biologie Moléculaire] Electrophorèse et Western Blot

Après migration, je souhaite transférer les protéines sur une membrane de nitrocellulose.  [...] Un gel à gradient serait l'idéal sinon si t'es vraiment sure de déposer et faire le gel exactement dans les mêmes conditions tu peux faire sur 2 gels séparés. Par contre si t'as vraiment besoin d'une quantification derrière je te conseille d'utiliser un même gel.   [...]

[Biologie Moléculaire] Western blot sur des echantillons de foie murins

Merci pour tes reponses. Je me suis trompee dans mon calcul, les valleurs ne sont pas negatives. Mes concentrations sont de l ordre de 45.000 a 130.ooo µg/mL. Je vais les diluer au 5 e et je pense que ca devrait le faire. Merci encore.   [...] Encore une. Que se passe t-il lorsqu'on load des concentrations élevées de protéines Est-ce que. la migration, le transfert et la révelation se font quand même Ou bien la concentration de protéine est-elle très importante dans les puits.  [...]

[Biologie Moléculaire] Western Blot Transfert sur membrane

Oui c'est ça je mets 3 membranes les unes sur les autres...et là j'ai des bandes bleues sur les 3 (les bandes de fin de migration) mais qd je les mets dans le rouge pinceau je vois aucune bande donc pas de transfert de protéine Ou un over transfert.  [...] - Présence de bulles d'air entre le gel et la membrane lors de la préparation du sandwich. Il se peut aussi que ton sandwich ne soit pas assez compressé lors du transfert (tu peux rajouter des éponges pour palier ce problème).  [...]