• Santé - Migration, Protéines, Membrane

[Biologie Moléculaire] Electrophorèse et Western Blot

Le problème étant que les protéines que je souhaite séparer sont de poids moléculaires très différents (par exemple. 500 kDa et 14 kDa).  [...] Un gel à gradient serait l'idéal sinon si t'es vraiment sure de déposer et faire le gel exactement dans les mêmes conditions tu peux faire sur 2 gels séparés. Par contre si t'as vraiment besoin d'une quantification derrière je te conseille d'utiliser un même gel.   [...]

Matériels et méthodes | Dossier

La migration électrophorétique ne se fera donc plus qu'en fonction de la masse moléculaire de chaque protéine, étant donné que chacune possède maintenant la même charge. L'électrophorèse a pour but de séparer les protéines sur un gel de polyacrylamide, ensuite ce gel est mis en contact avec une membrane de nitrocellulose et un courant allant du gel vers la membrane ce qui permet de fixer les protéines contenues dans le gel sur cette membrane.  [...] Dans chaque puits, il est déposé l'équivalent de 130 µg de protéines soit 110 µl de la suspension. La migration électrophorétique se fait à 50 V et pour une durée d'environ 15 heures, en fait c'est le front de migration formé par le bleu de bromophénol qui indique le moment où l'électrophorèse doit être arrêtée.  [...]

[Biologie Cellulaire] Dot blot

On ne sépare pas les protéines et la détection peut s'en trouver altérée (augmentation du bruit de fond notamment). Il n'y a pas d'électro-transfert et de ce fait la fixation des protéines sur la membrane est plus faible. On ne peut pas observer de shift de migration ou des migrations à des poids moléculaires aberrants et il est donc impossible de visualiser les modifications post-traductionnelles en utilisant un anticorps dirigé contre la forme totale.  [...] Je dis que ce n'est pas aussi rigoureux qu'un western parce que les protéines ne sont pas solidement ancrées dans la membrane et si un jour tu as l'occasion de faire un western et un dot-blot en parallèle hybridés avec le même anticorps tu pourrais avoir des surprises comme cela m'est arrivé.  [...]

Immunoblot

Entre la migration sur gel et l'autoradiographie tu as en plus une étape d'électro-transfert qui comme son nom l'indique permet simplement de transférer les protéines du gel vers une membrane (que tu vas ensuite utiliser pour faire l'autoradiographie), encore une fois grace à un champ électrique (car le sprotéine sont toujours chargées négativement).  [...] Le western blot consiste en une migration des protéines dénaturées au beta mercaptoethanol et SDS dans un gel de polyacrylamide+SDS (détergent qui va dénaturer les protéines et les charger), un transfert sur membrane et une révélation grâce à des anticorps marqués.  [...]

[Divers] Contenu "Matériels et méthodes" - rapport stage M1

Les extraits protéiques sont dénaturés à 95°C pendant 5 minutes en présence de LSB 1X final avant d'être déposés sur un gel de polyacrylamide dénaturant à 6%. Les immunoprécipitations sont dénaturées à 95°C pendant 5 minutes dans 25 µl de LSB 2,5X. Après migration électrophorétique, les protéines sont transférées en milieu liquide sur une membrane de nitrocellulose (HybondTM C Extra, Amersham Bioscience) pendant 1h30 dans un tampon de transfert (50 mM Tris base, 40 mM Glycine, 1,3 mM SDS et 10% éthanol).  [...] Après transfert, la membrane est bloquée dans une solution de lait 5% TBS-Tween 0,2% pendant 1 heure à température ambiante sous agitation. Elle est ensuite incubée avec les anticorps primaires anti-BRCA1 monoclonal (D9) dilué au 1/500 (Sigma®), anti-HSP60 monoclonal (CK) au 1/1000 (Sigma®) pendant une nuit à 4°C sur une plaque rotative.  [...]

[Biologie Moléculaire] western blot / proteine hrp

Je ne comprends pas bien. On peut tout à fait faire un western avec SDS et utiliser un anticorps couplé à la péroxydase. Le SDS agit pendant la migration mais une fois que les protéines sont sur la membrane, il n'y a plus de SDS et si il en reste il disparaît avec les lavages donc aucun problème pour la péroxydase (et d'ailleurs intuitivement ça coule de source car les anticorps que vous allez utiliser, avant la péroxydase, nescessitent leur conformation 3D ce qui prouve que le SDS ne bouleverse pas la manipe une fois que l'on est sur la membrane).  [...] Je voudrais faire la même manip que toi. Quelle est la composition de ton tampon de transfert Tu as transféré tes protéines sur membrane avec le système Biorad.  [...]

Matériels et méthodes | Dossier

Pour la translocation, après incubation des granulocytes neutrophiles avec un stimulant, les fractions membranaires et cytosoliques sont séparées par ultracentrifugation. Ensuite, les protéines sont dénaturées à 100°C en présence de sodium dodécyl sulfate (SDS).  [...] Dans chaque puits il est déposé l'équivalent de 130 µg de protéines soit 90 µl de la fraction membranaire et 100 µl de la fraction cytoplasmique. La migration électrophorétique se fait à 50 V et pour une durée d'environ 15 heures, en fait c'est le front de migration formé par le bleu de bromophénol qui indique le moment où l'électrophorèse doit être arrêtée.  [...]

[Biochimie] migration sds page

Je te conseille de transférer sur des membranes de PVDF préalablement mouillée dans du méthanol. La capacité de charge en protèïnes est plus importante (le double de la nitrocellulose).  [...] Je commence par vérifier la qualité du transfert par une coloration rouge ponceau, et c'est là que je me rends compte de la qualité de la migration de mes protéines. Après le rouge ponceau je rince la membrane dans du PBS et je fais une immunorévélation de ma (mes) protéines d'intérêts.  [...]

Définition | Laminine | Futura Santé

Protéine de la membrane basale des cellules jouant un rôle dans l'attachement et la migration des cellules lors de l' embryogenèse.  [...]

[Biologie Cellulaire] Metastase, MMP, intégrines

Les MMP ont une spécificité de dégradation. Elles dégradent certains collagènes, comme le collagène de type IV, qui eux-mêmes peuvent ainsi générer des fragments favorisant l'angiogenèse. Elles dégradent donc les protéines de la matrice extracellulaire qui vont entraver leur migration et pas forcément les aider à migrer via les intégrines.  [...] Je finirais par une petite précision, à creuser chez les MMPs. Certaines sont ancrées à la membrane plasmique. Lorsque la cellule migre, elle est polarisée. Peut-être la cellule se sert de cette polarisation pour placer les MMP membranaire vers l'avant de la cellule, relativement au sens de migration, pour favoriser une dégradation ciblée de la matrice extracellulaire. Ce n'est qu'une hypothèse.  [...]