• Santé - Migration, Fragments, Site, Restriction

Technique : RFLP

Si le fragment possède un site de restriction X, il est clivé en ce point (par l'enz. de restriction correspondante) et il y aura migration de fragments plus courts que si ce site de restriction est absent (mutation).  [...] tu as dis précédemment que l'adn était coupé en point x (car site de restriction) et cela donnait des fragments. Soit, mets tu dis que s'il y a absence de ce site alors il y a migration de fragments plus courts ce ne serait pas le contraire par hasard, car si présence de site de restriction alors ca coupe donc longueur moindre que s'il n'y avait pas de site.  [...]

[Biologie Moléculaire] Rflp

Pour la technique RFLP, tu utilise des enzymes de restrictions,ça marche dans le cas ou tu as des rflp,c'est à dire des SNP(single nucleotide polymorphism) qui sont dans un site de restriction.ainsi, selon l'allèle, l'enzime clivera ou pas son site, ce que l'on observe par migration sur gel.  [...] D'accord merci donc si je comprend bien la technique du southern blot ne demande pas forcément de cliver les brins par une enzyme de restriction. La sonde peut hybrider directement les brins d'adn dans ce cas.  [...]

clonage/enzyme en dehors du site multiple de clonage

Bonjour à tous, je vous sollicite pour une petite question. Lors d'un TP, j'ai inséré un fragment d'ADN dans un plasmide et derrière, pour vérifier la ligation, j'ai digéré le plasmide avec les 2 enzymes de restriction utilisé à la base et après migration sur gel il se trouve que au lieu d'avoir 2 fragments attendus (un fragment correspondant à mon plasmide et un fragment correspondant à mon insert) je n'ai qu'une seule bande.  [...] Il se peut que ton MCS ait été enlevé au cours du clonage (c'est normalement peu probable si tu as bien designé ton clonage). Il se peut également que le plasmide de départ soit muté et ne possède pas certains sites de restriction (également assez peu probable).  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème de construction d'une banque d'ADNc

En ce qui concerne le vecteur, il est commercialisé sous sa forme digéré par Sfi I donc je ne peux pas le recirculariser... j'ai déjà vérifié qu'il est sous sa forme linéaire par migration sur gel d'agarose.  [...] La vérification du clivage des ADNc par une enzyme de restriction peut se faire si le clivage génère des fragments de taille différente et suffisamment longs. Ainsi par migration sur gel d'agarose, la présence des bandes d'intérêt permet de valider le clivage.  [...]

[Biochimie] Pcr

Bonjour, je révise la pcr mais je ne comprends pas une fois la pcr effectuée et le fragment voulu sélectionné. On en fait quoi Enzyme de restriction puis migration Séquençage.  [...] * Si ta mutation est associé à un polymorphisme, type RFLP par exemple, tu peux extraire sur gel ton produit de PCR, digérer, et regarder le profil de restriction obtenus.  [...]

TPE sur l'ADN aide pour l'électrophorèse :)

pour couper l'adn je sait qu'on a l'habitude d'avoir recours a des enzymes de restriction qui sont spécifique a certaines séquence sur l'adn mais honnêtement ça me semble très compliquer de réaliser ça a votre niveau.  [...] Tu utilises des enzymes de restrictions (endo ou exonucléases) qui vont te faire pleins de petits bouts d'ADN. Tu vas faire migrer ces fragments d'adn sur membrane (électrophorèse) et tu vas avoir ce qu'on appelle un profil de migration électrophorétique.  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème de ligation??

Pour la vérification du clivage des inserts, il n'y a pas vraiment de méthode rapide de vérification si ce n'est la réussite du clonage lui-même. Si les parties flanquant les sites de restriction utilisés sur l'insert sont suffisamment longues, en migration électrophorétique tu verras une bande spécifique du clivage apparaitre, c'est à ma connaissance le seul moyen de vérifier si cette étape marche.  [...] une bande à 800 pb (insert), à 1600 (dimère d'insert), 2400 pb (trimère),...Cela montre que l'insert se ligue à lui-même grâce au fait qu'il soit clivé par la même enzyme de restriction à chacune de ses extrémités. Pour un clonage orienté, je doute que cette vérification soit aussi évidente.  [...]

[Biologie Moléculaire] pcr

Le marqueur de référence est placé dans un autre puit situé à la même hauteur. On applique ensuite un courant électrique à ce gel et les fragments d'ADN (naturellement chargés négativement) migrent dans le gel vers la borne positive. Cette migration se fait différemment selon la taille des fragments.  [...] plus ils sont petits et plus ils migrent vite vers la partie inférieure et positive du gel. C'est donc au cours de la migration que se fait la séparation entre ton ADN de départ (très grosse molécule qui restera en haut du gel) et les amplifiats (fragments plus petits qui seront plus bas dans le gel).  [...]

Les empreintes génétiques !

Coucou, je suis pas super calé la dessus, mais je sais qu'il faut utiliser des enzymes de restrictions pour couper les séquences d'ADN spécifiques voulues, puis de chauffer pour séparer les 2 brins, avant de faire une électrophorèse sur gel d'agarose en oubliant pas d'ajouter un agent intercalant comme le BET.  [...] On obtient alors une empreinte constituée d'une succession de fragments d'ADN de taille différente. Cette empreinte est en général spécifique d'un individu.  [...]

[Biologie Moléculaire] Temps de migration de long fragments d'ADN

Je pense pas pouvoir m'aider de la migration du bleu, il me semble avoir lu quelque part qu'il se comportait comme un fragment de 300 à 1000 pb.  [...] Pour les grands fragments il faut passer par une électrophorèse en champ pulsé pour les séparer convenablement dans un gel d'agarose. Pour le gel il me semble évident qu'il faut prendre le moins concentré, 0,5-0,6%. Le temps de migration c'est au feeling. Vous faites migrer une ou deux heures, vous regardez sous UV, si ce n'est pas bon, vous refaites migrer etc.  [...]