• Santé - Membrane, Tampon, Transfert

[Biologie Moléculaire] Western Blot Transfert sur membrane

Ha ben c'est peut être juste des traces de tampon de charge et pas un over transfert... mais bon j'y crois moyen. Je révèle ma membrane demain après passage à l'anticorps secondaire. La dernière fois j'avais rien.  [...] Je pense que ça peut venir du moment où je fais mon sandwich car j'immerge tout dans le tampon de transfert alors que j'ai vu une video où il immerge que l'éponge et fait son sandwich dessus ainsi peut être que le gel at la membrane adhère mieux.  [...]

[Biochimie] bruit de fond western blot

Je sais que nous on réutilise le méthanol dans lequel on a trempé la membrane car apparemment on a pas le choix d'utiliser du méthanol par contre pour le tampon de transfert, on peut utiliser de l'éthanol à la place du méthanol.  [...] Je confirme, méthanol pour mouiller la membrane c'est mieux, il suffit de tremper dans quelques ml sous la sorbonne, 30 sec juste histoire de mouiller la membrane, rien de si contraignant... Ensuite on peut la mettre à équilibrer dans le tampon de transfert pour lequel on utilise de l'éthanol.  [...]

[Biologie Moléculaire] Purification d'un serum à partir d'une membrane de nitrocellulose

Dans le cadre de mon mastére, je me propose de purifier un serum à partir d'une membrane de nitrocellulose,l'anticoprs j aurais à l utilisé pour une chromatogrphie d'affinité pour purifier une proteine periplasmique.  [...] Donc en gros, je fais migrer un echantillon contenant la proteine toxoplasmique P30 par SDS-PAGE puis aprés transfert, saturation et incubation avec un serum (à purifier) je coupe une portion de la membrane qui correspond a la proteine d interet et j utilise un tampon d elution pour eluer les anticorps a partir de la membrane.  [...]

[Génétique] Adn

voila le probleme. je dois preparer un tampon de transfert des proteine sur une menbrane pour un test de type western. sachant ke la formulation de ce tampn est. 25mM de tris, 192mM de glycine et 20%(V/v) de methanol. on demande comment preparer 500 ml de ce tampon ( ja i reponde a la kestion) ensuite, on demande a quoi ca sert le methanol dans ce tampon.  [...] voila le probleme. je dois preparer un tampon de transfert des proteine sur une membrane pour un test de type western. sachant que la formulation de ce tampon est. 25mM de tris, 192mM de glycine et 20%(V/v) de methanol. on demande comment preparer 500 ml de ce tampon ( j'ai deja repondu a cette question) ensuite, on demande a quoi ca sert le methanol dans ce tampon.  [...]

[Biochimie] tampon de lyse

Qu'est ce qui te fait dire que tes protéines d'intérêt ne sont pas solubilisées par le tampon de lyse Les protéines que tu regardes sont-elles membranaires, localisées dans un sous-compartiment cellulaire particulier, les surexprimes-tu Comment lyses-tu tes cellules (composition tampon, étapes physiques de lyse (choc thermique, piston Dounce, vortex, sonication,...)).  [...] j'ai lysé mes cellules par un tampon de Karla au Bertin,le tampon renferme dees antiprotéase,PMSF,NAF,EAU,Napp.Je cherche aussi bien des protéines membranaire et du stress oxydative certaine sont cytosolique,c'est bisard j'ai fais un dosage BCA j'ai des concentrations trés faible en protéine entre é 2 et 5 mg/ml mais c'est jouable pour déposer en faisant l'éléctrophorése à la fin du transfert j'ai révéler au ponceau il n'ya pas eu de transfert sur ma membrane et effectivement à la révalation d'une protéine j'ai rien vu au chémidoc alors que les marqueurs ont transférer.  [...]

[Biologie Moléculaire] Vérification transfert W.Blot

En fait quand on fait un western, on part du principe que pour des proteines de taille standard, si elle ne sont plus dans le gel apres transfert et coloration au bleu de coomassie, alors elles sont sur la membrane. Ceci est vrai si la polarité a été respectée durant le transfert, sinon les protéines sont dans le tampon et pas sur la membrane (mais dans ce cas, ce sont toutes les protéines).  [...] La membrane 1 te servira pour l'immunoblot. En général, au cours d'un transfert tu as des protéines qui traversent et que tu perds. Tu vas mettre à profit ceci et la sensibilité du coomassie pour tester ton transfert.  [...]

[Biologie Moléculaire] western blot /tampon de transfert

Je dois faire des western blot sur proteine petit PM (20kDA), mais avant mon maitre de stage veut que j'optimise les conditions donc je fais juste des western avec la beta actine, et le transfert sur membrane ne marche jamais. J'ai essayé 1h 100V (je mets 3 membranes pour vérifier) j'avais des bandes bleues sur les 3 membranes et encore des protéines sur mon gel, 2h 50V, pareil.  [...] Pour répondre au dernier message, pour ma part lors des transferts de ma protéine de 26kDa que je faisais sur membrane PVDF avec le même tampon ou très très proche. Je ne dépassais pas les 25 V mais pendant 50 minute-1h. Maintenant, je t'avoue je n'ai jamais essayé autant de volt et temps pour un transfert.  [...]

[Biologie Moléculaire] Tampon SDS-PAGE

le SDS dans un WB permet aux protéines d'avoir une charge proportionnelle a leur masse et donc de les faire migrer selon leur poids moléculaire indépendamment de leur structure. Le SDS a d'autres utilités, on le trouve dans certains tampons de lyse ou il a un role de détergent des membranes.  [...] Son utilité est de dissocier le SDS de la protéine afin que celle-ci puisse interagir avec la nitrocellulose ou le PVDF, et y rester fixée. Pour cette raison, il est important que le pH du tampon de transfert soit entre 8 et 8,5 pour que la protéine migre bien vers la membrane puisque sans SDS elle migre selon ses propres charges et non plus celles du SDS qui l'entouraient.  [...]

[Biologie Cellulaire] membrane PVDF et methanol

tout pareil, dans l'activation de la membrane comme dans le tampon de transfert, le methanol est substituable par de l'EtOH100%.  [...] au niveau du tampon, il faut bien utiliser 20% d'éthanol, car j'ai lu des articles où ils ne mettaient pas d'éthanol dans le tampon sur une membrane PVDF. alors je me pose des questions.  [...]

[Biologie Moléculaire] western blot / proteine hrp

En fait ce que je voulais savoir c'est s'il est possible de faire migrer sur gel une proteine couplée à la peroxydase puis de la transferer sur membrane et cela en condition non dénaturante pour que la peroxydase après avoir été blottée puisse encore réagir.  [...] Je voudrais faire la même manip que toi. Quelle est la composition de ton tampon de transfert Tu as transféré tes protéines sur membrane avec le système Biorad.  [...]