• Santé - Mammifères, Plasmide, Expression

Transformation/inativation d'un gène

Chez les cellules de mammifères normales il n'y a pas de plasmide et pourtant tu peux très bien faire de l'expression plasmidique.  [...] Dans ce cas tu dois transfecter de l'ADN linéaire, tu fais ta construction et tu linéarises. Si tu as créé une cassette dans ton vecteur bactérien tu purifie après linéarisation. Si tu veux utilisé tout le plasmide en entier je passerai sur gel quand même pour être certain que tu as que de l'ADN linéaire.  [...]

[Génétique] exprimer une protéine dans E.COLI

il n'y a pas de plasmide replicatif pour les cellules de mammiferes. Au moins tu fais de l'expression transitoire, sinon tu utilises des vecteurs viraux.  [...] en effet il faut abaisser la temperature de croissance des bacteries pour diminuer le taux d'expression et donc le risque d'avoir des corps d'inclusion.  [...]

[Biologie Moléculaire] Purification d'un plasmide à partir de cellules mammifères??

Pensez-vous qu'il soit possible d'isoler et purifier un plasmide (EBV = pas d'intégration et expression à long terme sous sélection) à partir de mes lignées cellulaires transfectées.  [...] Merci des conseils je ne sais pas si je vais le faire tout de suite mais si j'essaie je vous tiendrai au courant. En fait mon idée serait de faire une sorte de criblage car en gros je complémente un phénotype de blocage du cycle en transfèctant certains micro-ARNs et je me dis qu'en transfectant un pool de micro-ARNs (exprimés via ce plasmide) je pourrai récupérer les clones qui poussent et alors regarder quel(s) micro-ARN(s) a favorisé la prolif.  [...]

[Biologie Moléculaire] amplification: PCR vs plasmides

Dans notre expérience (expression d'amylase par des cellules mammifères qui ne l'expriment pas), on a récupéré le cDNA, amplifié par PCR, puis insérer dans des plasmides, inséré dans des E.Coli et amplifié. Pourquoi l'amplification pas PCR n'a pas suffit.  [...] Comme l'a précisé Piwi, une amplification par PCR est moins fidèle qu'une amplification par culture bactérienne, à moins d'utiliser des enzymes High Fidelity (Pfu, KOD, Herculase...) qui généralement coûtent au final plus cher en amplification et séquençages que le matériel et le temps nécessaires pour faire une culture de bactéries et une prep de plasmide.  [...]

[Biologie Moléculaire] Plasmide

Dans ta dernière question, je suppose que tu suggère d'intégrer un plasmide dans une cellule eucaryote et de le garder en tant que tel, c'est à dire qu'il ne s'intègre pas au génome. Je pense que c'est possible de façon spontanée chez S. Cerevisiae. Pour des cellules de mammifères, cela nécessite qu'elles soient au préalable transformées avec l'antigène T de SV40, comme c'est le cas pour les cellules Cos-7.  [...] Cet antigène permet au plasmide d'être répliqué par la cellule, et donc d'être conservé pendant une période plus longue. Sauf exception, la présence de cet antigène est absolument nécessaire dans les cellules de mammifères pour qu'il y ait réplication d'un plasmide.  [...]

[Biotechnologie] Clonage Eucaryote

L'expression transitoire consiste a faire rentrer une molecule d'ADN en sachant que celle-ci ne sera pas repliquer, mais comme les cellules de mammiferes se multiplient doucement, l'effet de dilution n'est pas super important.  [...] Oui mais pour utiliser un plasmide dans une cellule de mammifères, faut il alors qu'il y a ait une origine de réplication de type virale ainsi qu'un promoteur type viral.  [...]

Epigénétique : Emergence de nouvelles espèces

Il y a aussi chez les espèces zygotes l'empreinte parentale où l'expression allélique dépend du sexe du parent, en particulier chez les mammifères où on se heurte à des mécanismes non identifiés aboutissant à la mort quand on tente d'avoir une expression parthénogénétnique (= tous les allèles d'un seul des parents).  [...] En gros, dans le cas d'une empreinte parentale, je retrouve un peu partout que l'un des deux gènes ne s'exprime pas, cause de méthylation, etc..Et là j'ai tilté que je ne savais même pas pour quelles raisons un gène récessif n'a pas d'influence, car justement, quand on parle de non influence est-ce que ça veut dire qu'il s'exprime, mais que les conséquences de cette expression sont masquées par l'expression du dominant, ou est-ce simplement qu'il ne s'exprime pas.  [...]

Le sexe des bébés serait déterminé par un virus

Chez les mammifères, y compris l'être humain, le sexe pourrait être déterminé par une simple modification d'un virus fossile incrusté dans l'un des chromosomes sexuels. En fonction de l'expression ou du silence de l'invité viral, l'avantage serait donné au genre féminin ou masculin.  [...] La nouvelle étude apporte une autre idée. un virus influencerait le devenir du chromosome X au cours de la fécondation des mammifères, du moins chez la souris (rappelons que la femelle présente des chromosomes XX et le mâle des chromosomes XY). Plus précisément, au stade embryonnaire précoce, un mécanisme épigénétique (c'est-à-dire induit par l'environnement au sens large) empêcherait l'expression des gènes du virus intégré au chromosome X, ce qui, in fine, déterminerait le sexe du bébé.  [...]

L'expression des gènes hérités du père serait plus forte

Même si vous ressemblez beaucoup à votre mère, une étude novatrice suggère que les humains, et les mammifères en général, sont plus proches génétiquement de leur père que de leur mère quand il s'agit de leur expression.  [...] Ce déséquilibre donnait lieu à des descendants dont l'expression génétique cérébrale était considérablement plus proche de celle de leur père.  [...]

[Biologie Moléculaire] mutagènese, transformation, transfection

La suite est un peu plus floue, je reconstruit. Vous avez fait votre mutagénèse en bluescript (vecteur de clonage). Vous souhaitez exprimer votre insert dans des cellules de mammifères. Il vous faut donc un vecteur d'expression eucaryote. Du coup le transfert Bluescript -.  [...] Tu as 2 transformations distinctes en fait. Une première, avec les bactéries, qui te sert à amplifier le plasmide et réaliser la mutagenèse dirigée. Ensuite, tu récupère ton bluescript et tu transfert dans le vecteur POZ. Ensuite, tu transformes des cellules eucaryotes avec le vecteur POZ.  [...]