• Santé - Lignée, Plasmide, Résistance

[Génétique] Gène inconnu

En oubliant la thermostabilité, ne serait il pas plus simple de prendre une lignée de bactérie possédant un plasmide codant pour un quelconque rapporteur (résistance à un antibio, Lacz, Luc, etc...). C'est exactement le même projet, sauf que cette fois ci, il est réalisable.  [...] culture de la ligné 1 (portant le plasmide) et de la lignée 2 (pas de plasmide) sur milieu sélectif. Les bactéries 1 répondent à la sélection, pas les bactéries 2.  [...]

[Biologie Cellulaire] HEK et nitrogène

je cultive depuis plus d'un an une lignée HEK293 transfectée avec un plasmide donnant une résistance à la néomycine. Avec le temps mes cultures ont de plus en plus de mal à redémarrer (même les échantillons à faible passage) et je me demande s'il ne s'agit pas des conditions de stockage (mon protocole de culture n'a pas varié depuis).  [...] Même boite depuis le début, pour le SVF (j'emploie en fait du bovine growth serum, moins cher) le lot que j'utilise convient tout à fait après que les cellules aient redémarré, le problème réside vraiment au moment de redémarrer des échantillons congelés comme pré-cité.   [...]

[Biologie Cellulaire] Compter les passages

Bon en fait j'ai une lignée qui exprime une récepteur calcique transfecté avec un plasmide comprenant une résistance (G418) Donc à chaque passage, je dois avoir des cellules exprimant assurément le plasmide (autrement ils n'auraient pas la résistance et mourraient) et donc le récepteur en question.  [...] Il est possible que malgré la présence du gène de resistance, et la sélection, tu perdes l'expression de ta protéine, si celle ci est +/- toxique pour la cellule. Seront alors selectionné (au sens Darwinien) les cellules exprimant peu ou plus cette protéine.  [...]

[Biologie Cellulaire] Plasmide eucaryote/bactérien dans une lignée cellulaire

Dans ta population de cellules après transfo seulement une partie a pris le plasmide. Si tu n'as pas de marqueur sur ce plasmide pour le sélectionner tu ne sauras pas si ta transfo a marché mal/bien/très bien et donc l'efficacité de ta transfo.  [...] J'utilise des HEK-293 et mes conditions de transformations pour cette souche sont optimales (~ 90% de cellules transformées). J'ai déjà transformée cette lignée avec d'autres plasmides qui ont bien exprimés leur gène donc je doute que ça soit la transformation qui pose problème.  [...]

[Biologie Moléculaire] Transduction/transfection

Les cellules font aussi des recombinaisons heterologues. Pour les selectionner, on utilise generalement de la puromycine (le vecteur possede le gene de resistance). Alors seules les cellules qui auront intégré aleatoirement ce plasmide dans leur chromosome pourront survivre. On obtient donc des lignées stables.  [...] Et si je peux rajouter, en fait, une transfection en stable est une transfection transitoire très raccourcie (ou le plasmide n'a pas eu le temps de s'intégrer). Quand tu veux regarder l'expression en transitoire, tu regardes généralement 24h-48h après la transfection, pour les stables, le temps d'établir la lignée, tu en as pour 1-2 mois.  [...]

[Biologie Cellulaire] probleme de transfection

Normalement je devais cotransfecter dans une lignée cellulaire un plasmide avec le promoteur qu'on étudie et qui contrôle l'Expression de la luciferase, et le plasmide controle codant pour la beta-Gal.  [...] Problème. une fois la transfection finit (seulement 5-10 minutes aprés), je m'aperçois que la personne qui a écrit les concentrations de plasmides a fait une erreur. Donc mon plasmide control est 10 fois moins concentré…du coup dans la panique (il me faut absolument réussir cette transfection) j'ai procédé a une autre transfection sur les mêmes cellules avec le plasmide contrôle pour essayer de complémenter (dans les 30 minutes après la première transfection)…je sais c'est stupide. Mais quand on panique….  [...]

[Génétique] Création variétale

ca sera l'inverse, (rendre la variété 2 resistante en gardant sa productivité) car il est plus facile d'introgresser une resistance dans une variété (controlée par peu de gènes) que d'introgresser une qualité de rendement (qui sont la résultante de beaucoup de choses).  [...] Au 7eme backcross environ, tu auras une lignée quasiment identique a la lignée V2 (grace aux retrocroisements successifs avec V2) mais qui aura la resistance de V1 (car selectionnés depuis le début et a chaque nouveau croisement en recroisant uniquement les pieds résistants).  [...]

[Biologie Cellulaire] Transfection et nombre d'intégration

Je pense que si donne la taille du plasmide, le kit et la lignée cellulaire, on paurrait te donner une réponse plus fiable.  [...] Tu peux vérifier dans ton expérimentation le nombre de copie par pcr quantitative.   [...]

[Biologie Moléculaire] Recherche marqueur vital pour noyaux de myoblastes

Je souhaite créer une lignée de myoblastes ayant les noyaux colorés. J'ai essayé de les transfecter avec un plasmide qui colore les histones en vert (GFP) mais il ne me reste aucune cellule vivante.  [...] Avez vous d'autres idées concernant des marqueurs pour noyaux Il faut que ce soient des marqueurs vitaux et que la coloration dure dans le temps.   [...]

[Biologie Cellulaire] Dominant négatif

bonjour tout le monde, est ce que quelqu'un peut m'expliquer comment ça marche concrètement une expérience de dominant négatif j'ai ma lignée cellulaire ou je veux éteindre ma protéine, je les transfecte à l'aide d'un plasmide contenant la séquence mutée et je la trouve ou cette séquence et le plasmide ça s'achète ma question est peut être bête mais je n'ai jamais fais ça alors j'ai besoin d'éclaircicements, merci.  [...] Où trouver un dominant négatif Soit il est déja caractérisé dans la littérature, auquel cas tu peux contacter le labo qui a publié pour avoir le plasmide, ou bien il est commercialisé, sinon, il faut le faire. La ce sera de la mutagénèse dirigée, mais concernant le site à muter, cela dépend de la fonction de ta protéine que tu souhaites éteindre.  [...]