• Santé - Kit, Extrémités, Vecteur

[Biochimie] Topoisomérase et kit " TA cloning" ...

Je ne comprends pas le rôle de la topoisomérase dans le kit de TA cloning qui permet de créer des extrémités cohésives sur un vecteur de clonage..( ajoute un T aux extrémités du vecteur, et un A aux extrémités du produit PCR à inserer dans le vecteur ).  [...] La topoisomérase est liée de façon covalente au vecteur, ce qui le rend plus réactif. L'activité catalytique de cette enzyme n'est pas exploitée, seulement sa capacité à se lier aux nucléotides.  [...]

[Biologie Moléculaire] Gros problème.....

je suis sensée créer un vecteur d'expression (Kit Qiagen pcDNA 3.1 TOPO isomerase) à partir de clones bactériens contenant notre protéine d'interet.  [...] J'ai ensuite réalisé une PCR avec le kit de ma Pfx (afin d'obtenir un insert à bouts francs pour pouvoir l'insérer dans mon vecteur d'expression), puis une gel d'agarose 1.5%.  [...]

[Biologie Moléculaire] Détection d'une protéine

j'ai ensuite séquencé mes produits d'amplification (amorces dessinées spécifiquement en 5' et 3' de mon insert) pour vérifier que mon insert était correct et surtout entier. Et là, problème ma protéine est tronquée de 4nulcéotides... (sans doute dû à une mauvaise hybridation de mon amorces et donc mauvaise amplification.   [...] Sinon pas le choix, faut refaire le clonage. S' il y a encore des sites de restrictions uniques en 3', il est possible d'y cloner une séquence composée de 2 longs oligos hybridés codant pour une étiquette, mais ca ne me semble pas beaucoup plus simple que de recommencer malheureusement.   [...]

[Biologie Moléculaire] Problème lors de la transformation avec DH5a E.coli.

Après extraction de mes bandes d'ADN obtenu sur gel, j'ai réalisée une purification avec le kit nucléoSpin Extract II de Macherey Nagel. Ensuite j'ai vérifiée sur gel que je n'avais pas perdu trop en quantité d'ADN pour la ligation. J'ai donc effectué la ligation sur vecteur de clonage pGEMT-easy de Promega en laissant une nuit à 4°C puis T°ambiante.  [...] 1 contrôle sans le fragment et sans ligase qui permet de discriminer si le bruit de fond vient d'une mauvaise digestion ou d'une mauvaise déphosphorylation (ce témoin n'est pas très utile avec des vecteurs dT overhang tels que pGEMT-easy).  [...]

[Biologie Moléculaire] Ligation

Je ne pense pas qu'il y ait problème au niveau du mix réactionnel (j'ai fait tout les calculs) mais plutôt au niveau des extrémités soit du vecteur soit des insert. Je suis entrain de tout reprendre et je ferai en sorte de lancer les ligations le plus rapidement possible.  [...] j'ai fait des recherches sur le kit in-fusion. Je pense que je l'utiliserai bien en dernier recours. Avant tout j'ai pas envie de laisser tomber aussi facilement sans savoir ce qui cloche. Aussi j'ai une autre question qui va d'une observation. A chaque fois (plus de 10fois) que j'ai fait des ligations vecteur d'expression pET45b + inserts d'interet (1330bp, 1894bp et 958bp) après transformation des Top10 puis étalement sur boite j'obtient toujours moins de colonies bactérienne dans la transformation effectuée avec l'insert de 1894bp quand bien même j'ai mis la même quantité de vecteur dans chaque produit de ligation.  [...]

in-fusion cloning

J'aimerai savoir si l'un de vous avez déjà tenté de faire un clonage en utilisant un in-fusion cloning kit sans linéariser le vecteur cible.  [...] j'ai la séquence de mon épisome mais je n'arrive pas à le couper avec des enzymes de restriction qui sont sensées le couper. C'est pour cela que j'aimerai savoir si il en linéarisant ma construction et en utilisant la recombinase il y a des chances que j'obtienne la fusion des deux.   [...]

clonage qui ne fonctionne pas ? ratio ?

Je n'ai pas essayé de déphosphorylé, cependant, j'essaye actuellement en parallele un clonage qui ne necessite pas de déphosphorylé le plasmide (digestion par deux autres enzymes generant des exttrémités non compatible afin que le vecteur ne se referme pas).  [...] J'ai essayé avec deux enzymes générant des extrémités non compatible pour eviter la déphosphrylation mais malgré tout cela n'a pas fonctionné.  [...]

Transfection plasmide gateway et faible expression proteique

Je veux transfecter des Hek293T, j'ai essayer différents kit d'extraction du plasmide, vérifié la sequence du vecteur et de ma protéine, verifié la concentration d'ADN, testé plusieurs concentrations... je ne sais pas quoi faire d'autre.  [...] Il s'agirait donc plus d'un problème venant du vecteur lui même mais je ne sais pas du tout où regarder (je suis plus physiologiste donc je suis un peu perdu dès qu'il s'agit de bio mol.).  [...]

[Biologie Moléculaire] séquençage ADN

Au début du message je signalais que ces plasmides de TA cloning dérivaient du pUC. Ils sont optimisés pour améliorer le rendement du clonage des fragments de PCR. Du coup en ouvrant un pUC tout bête avec une enzyme de réstriction qui génère un fragment à extrémités franches tu devrais pouvoir cloner tes PCR mais le rendement ne sera peut être pas très bon.  [...] le problème ca n'est pas de récupérer le vecteur c'est qu'il est fourni déjà linéarisé avec les extrémités prêtes à recevoir ta PCR et avec le milieu de ligation.  [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage en plasmides de grande taille via Sfi I (astuces)

(2) pour respecter mon ratio insert/vecteur molaire théorique (tout en restant dans un petit volume) je dois mettre beaucoup d'insert. cet excès d'ADN peut il inhiber la réaction de ligation 100 ng de matériel total cela vous semble une limite max à pas dépasser.  [...] Tu ne mets pas trop d'unités d'enzymes Tu digères combien de µg de vecteur et d'insert environ 350 µL final c'est beaucoup, tu dois pouvoir faire ça genre dans 100-150 µL max non.  [...]