• Santé - IP, Anticorps, Protéine

[Biochimie] Etude des partenaires protéiques : Co-Immunoprécipitation, Tap-Tag et double hybride

Et je me posais la question de savoir quel type d'anticorps fallait-il utiliser pour la Co-Ip Un anticorps poly ou monoclonal Si j'utilise un anticorps polyclonal, il risque de se fixer un peu partout sur ma protéine et je risque d'empêcher les interactions.  [...] tap-tag. c'est de l'in vivo aussi, y a pas le problème des anticorps comme l'IP, et c'est bien pur grâce à l'utilisation de deux colonnes justement, mais après c'est fait avec une protéine de fusion donc ça peut aussi changer l'interaction.  [...]

[Biochimie] Etude de la phosphorylation d'une protéine

Vu que j'ai l'anticorps contre ma protéine, je pensait faire une immunoprécipitation pour ensuite réaliser un blot anti ser/thr/tyr phorsphorylées. Ou l'inverse (IP anti ser/thr/tyr suivi d'un WBlot contre ma protéine).  [...] Heureusement cette protéine est couplée à l'EGFP, j'ai donc pu mettre au point une immunoprécipitation pour la séparer des autres protéines cellulaire sur SDS-PAGE. En parallèle je réalise un blot avec l'anticorps dirigé contre la protéine virale. Ensuite je découpe sur mon gel coloré au nitrate d'argent la bande immunoprécipitée correspondant à ma protéine.  [...]

Interaction entrée viral protéine cellulaire

Salut, je te remerci de ta réponse et c'est déjà ce que je pensais mais je doutais, par contre la 1iere D doit etre fait dans des conditions dénaturante comme le BN-Page. Et apres il faut que je vérifie si la ou les protéines identifiés servent dans l'infection virale.  [...] Quitte a synthetiser une proteine recombinante autant faire un pull-down avec une fusion GST-proteine X. Si tu utilises une etape anticorps, ne pas oublier de cross-linker l'anticorps avant l'IP... Un autre detail, identifier des proteines membranaires par mass spec n'est pas une partie de plaisir.  [...]

[Biologie Cellulaire] Co-Immunoprécipitation

5. Tu rajoutes un tampon dénaturant (SDS et b-mercaptoethanol), qui va dissocier et dénaturer les anticorps, libérant ainsi les protéines A et B.  [...] 6. Tu déposes sur gel et fait un Western Blot. Tu révèles avec un anticorps dirigé contre ta protéine B (alors que l'IP a été faite avec un anticorps contre la protéine A). Si tu as une bande au poids attendu pour B, cela signifie que tu as co immunoprécipité B avec A.  [...]

[Biologie Moléculaire] Immunoprécipitation

Je pense qu'il faudrait trouver un moyen de dissocier la protéine de la chromatine avant l'incubation avec l'anticorps, non.  [...] La protéine d'intérêt est-elle taggée L'anticorps utilisé pour l'IP est -il dirigé contre une étiquette Avez-vous essayé un WB sur le culot de billes après IP en procédant à une étape de dénaturation pour être sûr de dissocier la protéine des billes (parfois des anticorps se lie très fortement, dans ce cas il faut peut-être changer d'anticorps pour rester dans des conditions natives, ou alors tester avec des concentrations salines plus importantes).  [...]

[Immunologie] Recherche de modification de proteine par anticorps

- phosphorylation. il existe des anticorps reconnaissant spécifiquement votre protéine phosphorylée et il existe même parfois plusieurs anticorps différents si la protéine a possède plusieurs sites de phosphorylation. Si il n'existe pas d'anticorps vous pouvez faire une IP contre votre protéine et révéler avec un anti phospho tyrosine ou un anti phospho serine.  [...] - palmitoylation/miristoylation/farnésylation/.... la plupart des modification lipidiques peuvent être prédites par analyse de la séquence de la protéine étudiée. Souvent ces modifications peuvent s'observer en western-blot (comme la plupart des modification post-traductionnelles et on utilise des acides gras radioactifs comme l'acide palmitique marqué au tritium.  [...]

[Immunologie] Immunoprecpitation: liaison de la resine protG avec l'anticorps qui marche pas

Bonjour tous le monde. Je suis entrain de faire la mise au point d'une IP. pour se faire j'ai voulu juste tester le rendement de la résine protG avec l'anticorps sans rajouter la protéine d'intérêt. la résine ne capte même pas le 1/10 de la quantité de l'anticorps de départ qui est de 1µg dans 500µl de PBS avec 50µl de la résine.  [...] Je laisse la résine en contacte avec l'anticorps toute la nuit puis après je lave 3 fois avec du PBS et j'élue finalement dans 50µl de glycine 2.5.  [...]

Technique

dans le GST, il faut un tag GST, donc une protéine de fusion. Dans l'IP, pas besoin de protéine de fusion, on peut le faire sur une protéine native, mais il faut un anticorps spécifique.  [...] Tu peux donner des avantages et inconvénients de l'utilisation de méthode par rapport à une autre dans le cadre d'une question biologique ou d'un problème précis à résoudre que tu te poses, mais en donner de manière générale je ne vois pas vraiment.   [...]

[Biologie Cellulaire] poly-ADP-ribosylation de protéines

L'anticorps anti-PAR est une bonne alternative même si cela reste une démonstration indirecte de la PAR de ta protéine. Dans ce cas, je ferais une IP anti-ta protéine suivie d'un western blot anti-PAR pour démontrer qu'elle est PARée.  [...] Un autre probleme vient d'ailleurs de se poser. Il existe deux types de PARP III. celles qui ajoutent un seul adduit ADP-Ribose et celles qui ajoutent un polymére. Par de chance, l'anticorps ne reconnait que les protéines porteuses du polymére et non les protéines mono-Ribosylée.  [...]

[Biologie Moléculaire] Lecture Sequence ADN et WB

- Troisième question. l'IP vous dit quelle protéine on a immunoprécipité (ici DCC est immunoprécipitée), et WB vous dit quelle protéine a été marquée en western blot (ici p-y kinase). On utilise un anticorps polyclonal pour les immunoprécipitations et pour le western blot, si on détecte une autre protéine que celle immunoprécipitée, on utilise soit un monoclonal soit un polyclonal.  [...] Merci d'avoir répondu c'est plus clair pour les 2 premieres cependant pour la question sur le Western Blot ce que je n'arrive pas à comprendre les indications de l'experience et donc comment peut on avoir une bande caracteristique pour cet exemple et déduire par exemple qu'un produit X qu'on a rajouter induit la Phosporylation de DCC(recepteur)(en comparaison des intensités des bandes par ex).   [...]