• Santé - Idée, Amorces, Site, Restriction, Séquence, Protéine

[Biologie Moléculaire] Protéine de fusion

D'où mon idée de fabriquer une protéine de fusion avec la GFP. Malheureusement je ne sais pas trop comment m'y prendre. Malheureusement je ne trouve aucun site en commun me permettant de simplement digérer puis liguer ma GFP avant le codon stop de la protéine.  [...] Mon idée serait donc de créer des amorces PCR contenant en 5' un site de restriction commun à la séquence de ma protéine et se trouvant le plus proche possible de mon codon stop, et en 3' une partie de la séquence de la GFP afin de pouvoir amplifier la GFP.  [...]

[Biochimie] Clonage après purification sur gel

J'ai donc essayé de digéré mon plasmide ainsi que ma k7 de résistance (1 enzyme pour le vecteur mais 2 sites différents et 3 pour la k7 de resistance). Ce protocole n'a fonctionné qu'une fois. Depuis j'ai toujours des vecteurs ayant échappés à la quadruple digestion.  [...] J'ai une petite idée qui vaudra ce qu'elle vaudra. Pour enlever ta cassette de résistance, as-tu pensé à amplifier ton vecteur par PCR en prenant des amorces qui excluent la cassette de résistance (et qui incluent en 5' de tes amorces les sites de restriction plus quelques bases en 5' de chaque site de restriction pour pouvoir les cliver par la suite) Si ton vecteur provient de bactéries, il sera méthylé.  [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage par PCR taille des amorces

Une question simple. j'aimerais cloner un gène dans un vecteur pENTR. J'ai la séquence codante de ce gène dans un autre plasmide, je compte donc l'amplifier par PCR en rajoutant des sites de restrictions en 5' et 3' qui me permettront ensuite de le mettre facilement dans mon pENTR d'intérêt.  [...] Je me demandais donc la taille que devait faire mes amorces de PCR, et si je dois prévoir quelques bases entre le début (et la fin) de ma séquence codante et mon site de restriction. Car je me demandais si en juxtaposant les 2 sans rien ajouter entre, est ce que la coupure/ligation ne va pas endommager ma séquence codante.  [...]

[Biologie Moléculaire] Comment ajouter un petide signal à une proteine?

Mais j'ai peur de ne pas réussir a amplifier et purifier facilement mon peptide signal seul par PCR. est-ce possible sinon est-ce que quelqu'un a déjà fusionné un signal peptide a une protéine.  [...] Mais deux seulement suffisent. La premiere, qui amplifie le peptide signal, avec sur une des amorces un site de restriction (cohesif), que tu rajouteras egalement sur le sequence de la CFP de la meme maniere (sauf bien sur si c'est une CFP commercial, avec deja un bon choix d'enzyme qui coupe ou il faut).  [...]

[Biochimie] nucléase

Admettons voilà ton plasmide ouvert par deux enzymes différentes, une bleue une violette. -PROMOTEUR- site Enzyme de restriction 1 (du vide) site Enzyme de restriction 2 - TERMINATEUR-et on rejoint le promoteur puisque le plasmide est circulaire.  [...] Tu vas donc ajouter, par PCR et grâce à la séquence de tes amorces, des nucléotides en amont et en aval de ton gène. en amont, les nucléotides qui correspondent au site de restriction de l'enzyme 1, en aval, les nucléotides qui correspondent au site de restriction de l'enzyme 2.  [...]

[Biologie Moléculaire] Promoteur banque BAC

J'aimerai globalement connaitre la démarche pour récupérer une séquence promotrice d'une banque BAC pour ensuite le cloner dans un vecteur rapporteur et étudier ce promoteur.  [...] Tout dépend de la longueur de promoteur que tu veux mettre en amont du gène rapporteur. S'il n'est pas très long, tu peux réaliser une PCR avec des amorces encadrant la région promotrice que tu désires. En 5' des amorces tu ajoutes la (les) séquence(s) de restriction correspondant au(x) site(s) de restriction que tu as choisi sur ton vecteur pour l'intégration du promoteur.  [...]

Primer de PCR

Quand on donne une amorce pcr on donne la sequence nucleotidique, le site de restriction et le clamp.  [...] Sinon, dans une amorce dans laquelle tu rajoutes un site de restriction il y a une partie identique à ta séquence, ton site de restriction que tu dois faire précédé d'un triplet/quadruplet (voir plus) de nucléotiques pour assurer une restriction efficace (un site de restriction en extrêmité 5' d'une amorce, ce n'est pas top pour l'enzyme de restriction).  [...]

Bioinformatique - Etudes d'une sequence d'ADN

Et je cherche tous ce qui pourrait me permettre de caracteriser cette sequence pour pouvoir la comparer ensuite que ce soit des criteres connus et evidents tels que la presence de site de restriction ou les pourcentage de nucleotides ou meme n'importe quelles idees.  [...] Tu peu xtoujours t'amuser a rechercher le site de restriction EcoRI, mais c'ets vraiment du temps perdu...Tu peux t'amuser a recherche la probablite de codage d'une sequence, mais ca ne te renseignera pas sur une quelqueconque similitude avec un autre virus.  [...]

Clonage par PCR

J'ai une petite question... j'aimerais savoir a quoi correspond exactement l'expression clonage par PCR. Est-ce quand on ajoute en 5' de l'amorce la sequence specifique d'un site de restriction, ce qui permet ensuite de liger le produit de pcr dans un vecteur contenant le meme site de restriction (en resume) Ou bien est-ce autre chose.  [...] Je pense qu'il s'agit tout simplement d'un clonage à partir d'ADN que tu as amplifié par PCR q'il s'agisse d'une ligation après digestion enzymatique ou autre.   [...]

Déchiffrage d'une carte de plasmide

Les 2 lignes au dessus du plasmide correspondent aux différents sites de restrictions (éventuellement pour cloner une séquence dans ces poly-linker).  [...] La séquence de polyadénylation BGH est située juste derrière les sites de restriction ce qui permettra à ta séquence insérée de recevoir une queue polyA et tu obtiendra un ARNm fonctionnel (=traductible en protéine).  [...]