• Santé - Génome, Vecteur, Fragment

[Biotechnologie] Criblage d'une banque à partir du phage lambda

En TP, nous allons bientôt réaliser le criblage d'une banque construite à partir du phage lambda ZAP. Dans notre poly, il est indiqué que le génome de la bactérie utilisée pour l'infection fait 3,13x10^6pb et que la taille de l'insert est environ de 10Kb. A partir de ces seules données, peut-on prévoir/calculer la fréquence de phages positifs que l'on obtiendra à l'issue du premier criblage Et si oui, de quelle manière.  [...] Il y a une formule qui donne le nombre de clones nécessaires N en fonction de la probabilité p de présence de la séquence insérée (donnée que vous n'avez pas) et du rapport n entre la longueur du génome du phage vecteur et la longueur du fragment inséré.  [...]

[Biologie Moléculaire] pcr/clonage

Est ce qu'on fait la PCR apres avoir inseré les fragments d'intérets dans les vecteurs,ou est ce qu'on amplifie par PCR les fragments d'intérets qu'on insere ensuite dans le vecteurPour moi la PCR est une technique de clonage,donc si on connait la séquence qu'on veut cloner,une PCR est suffisante,il n'y a pas besoin d'utiliser de vecteurs apres.  [...] Il faut donc un promoteur en amont du fragment pour qu'il soit transcrit, il faut des séquences d'initiation de la transcription pour l'expression chez une bactérie, une séquence ori qui permet la réplication du vecteur et de son insert. Tout ceci se trouve dans un vecteur et est indispensable à l'utilisation du fragment isolé.  [...]

[Biologie Moléculaire] ADN complémentaire et PCR

3) Si nous avons un vecteur recombinant avec un fragment d'intéret et que nous souhaitons amplifier par PCR uniquement ce fragment d'intéret. en utilisant 2 amorces spécifiques des extrémités de ce fragment, faut-il.  [...] d'abord linéarisé le vecteur par un autre enzyme ou meme en le laissant circulaire, on ampliefiera seulement le fragment.  [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage

J'ai besoin d'aide pour un clonage. Je dois cloner un fragment d'ADN génomique bactérien dans un plasmide. La stratégie choisie est de linéariser le vecteur par digestion enzymatique, de le purifier sur gel, de le déphosphoryler et de faire la ligation avec l'insert.  [...] Et je bloque à cette étape. j'obtiens autant de clones pour mes bactéries transformées par le vecteur linéarisé que par celles transformées par le plasmide natif. J'en ai donc déduit une mauvaise digestion. Or, j'utilise les enzymes Fast Digest de chez Fermentas pour une digestion o/n.  [...]

Comment orienter un fragment d'adn dans un vecteur

On veut introduire ce fragment dans un vecteur contenant lui un promoteur, mais pour cela il faut le mettre dans le bon sens pour que l'ORF soit dans le bon sens par rapport au promoteur.  [...] Donc pour cela je suppose qu'on peut utiliser des primers avec une partie 5' non complémentaire qui permet de générer un site de restriction différent selon le côté du fragment ce qui permet d'introduire le fragment dans le bon sens en utilisant les 2 sites différents.  [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage avec plasmide

Ainsi, en ajoutant de l'ampicilline au milieu, seules celles avec un vecteur survivent. Vous sélectionnez les bactéries transformées, pas nécessairement celles qui contiennent votre fragment d'ADN d'intérêt.  [...] Ce sont les mêmes. Si vous souhaitez cloner dans le site BamHI d'un vecteur et que votre fragment d'ADN ne porte pas de site BamHI, vous allez créer des amorces PCR contenant NNNNNN-BamHI-extrémité5'dufragment et NNNNNN-BamHI-extrémité3'dufragment (antisens) Votre fragment amplifié sera NNNNNN-BamHI-fragment-BamHI-NNNNNN et vous pourrez générer votre fragment avec des extrémités BamHI libres qui pourront liguer avec celles de votre vecteur.  [...]

[Génétique] Thérapie génique: synthétiser le gène correcteur

Et ensuite il y a l'étape de l'insertion du fragment d'ADN, clivé par l'enzyme de restriction qui sera inséré dans un plasmide ou un vecteur.  [...] Merci beaucoup. J'ai une autre question. Comment fait-on pour insérer le fragment d'adn obtenu par les enzymes de restriction dans le vecteur.  [...]

[Biologie Moléculaire] compatibilité OriS et Ori de PMB1 dans un même plasmide?

Avec ce vecteur je vais cloner des grand fragment de type YAC et BAC, je me demandais si la présence de OriS et de l'origine de réplication de PMB1 pouvait poser des problèmes dans la transmission du plasmide aux bactéries filles, des pb de recombinaison ou autre.  [...] le but c'était de faire des recombinaisons chez la levure et de pouvoir électroporer directement le YAC dans les bactéries. Le vecteur possède 2 ori procaryotes car je l'ai construit en ligant des fragments de deux vecteurs différents (et je croyais avoir supprimé une des 2 oris mais après séquençage elles y sont toutes les deux).  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème avec mes transformations

Si je fais d'après ce protocole, il faudra que je refasse plus de produit de ligation. Mais je n'aurai plus assez de mon vecteur. Il faudra que je fasse à nouveau la restriction puis l'isolation du fragment.  [...] J'ai mesuré la concentration de mon fragment de vecteur. 2.15 ng/ul (je l'ai trop dilué alors maintenant la conc est assez basse).  [...]

[Biologie Moléculaire] Ligation

J'ai testé les différentes propositions que vous m'avez faites. J'ai pu obtenir des colonies ce matin. Seulement, il y a un souci, j'ai des colonies dans ma transformation témoin (bactéries transformées avec le vecteur ligaturé sur lui même). Je vais prendre le pari ce matin et essayer de faire des PCR de colonies pour voir si les fragments d'intérêt on bien été cloné.  [...] Sinon je ne comprend pas bine ton contrôle négatif Jusqu'à présent ce que je faisait comme contrôle négatif c'était de mettre le vecteur, la ligase mais pas le fragment.  [...]