• Santé - Fragments, Digestion, Plasmide

[Biologie Moléculaire] Enzymes de restriction sur plasmides- Digestion complète et incomplète

Quel est la différences entre une digestion complète et incomplète, et comment prévoir le nombre de fragments dans le cas d'une digestion incomplète.  [...] Par exemple, pour un plasmide ayant 3 sites de coupures, le nombre de fragments attendu (théorique) est de 6 si l'on considère tout les fragments possible et imaginable. Mais dans le cas d'une digestion incomplète, comment savoir s'il y aura 1 seul site ou 2 site qui seront impliqué dans la digestion du plasmide.  [...]

[Biochimie] clonage

Fais une digestion de ton plasmide avec tes enzymes, puis tu fais une électrophorèse sur gel ( de ton plasmide). Si tu as fait une digestion avec deux enzymes, tu devrais voir deux fragments en principe.  [...] mes inserts sont des produits de PCR, sur gel d'agarose c'est Ok j'ai des fragments avec les tailles attendues, les enzymes utilisées sont pour le plasmide BamH1-HF-EcoRI HF, pour le premier insert BamHI HF-NdeI et pour le second. NdeI-EcoRIHF, pour les quantités j'ai utilisé un rapport de 1-5 et dans une autre tentative1-3.  [...]

[Biotechnologie] Problèmes sur les notions/calculs de plasmide

Il choisit de faire pousser un certain nombre de colonoes bactériennes sélectionnées afin d'amplifier son plasmide et ainsi disposer d'une grosse quantité de son insert NIACUSE pour le séquencer et vérifier son intégrité. Il récolte les plasmides après lyse alcaline des bactéries et extraction de l'ADN au phénol/chloroforme.  [...] La première partie du devoir vise à vous faire trouver la taille du plasmide. D'où proviennent les fragments générés par la digestion enzymatique Pensez vous que le plasmide puisse faire 5807 pb alors que la digestion par BspI génère un fragment de cette parmis d'autres.  [...]

[Biologie Moléculaire] PCR colonie et PCR ADN

On pensait que cela pouvait être génomique. Mais nous avons testé 3 inserts différents dans 3 plasmides, les 3 donnent un produit de PCR sur colonie (témoin positif sur insert qui confirme, témoin négatif sans ADN qui confirme). Et les 3 perdent leur insert après Miniprep de la culture liquide.  [...] Quand tu dis que le plasmide est présent seul dans la miniprep, sais tu si il est sous forme linéaire ou circularisé par la ligation. (Une digestion avec une seule enzyme devrait donner 2 fragments si il est linéaire). Imaginons que la ligation ne fasse que circulariser le plasmide sans introduire l'insert, ça pourrait conférer la résistance et la PCR positive proviendrait de l'insert qui est transformé en même temps.  [...]

[Biologie Moléculaire] Carte de restriction électrophorèse

En supposant que dans la double digestion mes 2 enzymes aient coupé au même endroit, je pense pouvoir multiplier 3090 par 2 soit 6180 pb pour la double digestion ce qui serait cohérent avec les autres résultats. Mais je ne comprends toujours par le résultat de cette double digestion, car selon moi j'aurais du obtenir les mêmes résultats que la digestion EcoRI sinon je ne peux pas trouver la carte de restriction de mon plasmide.  [...] .. Dans la double digestion si mon hypothèse (les 2 enzymes bamHI et ecoRI coupent au même endroit), j'aurais 2 fragments identiques dans mon plasmide ce qui ne coincide pas avec la digestion de EcoRI. Et pourquoi mes 2 enzymes auraient-elles coupées au même endroit.  [...]

[Biologie Moléculaire] Carte de restriction

Il doit y avoir un souci dans vos données. Normalement, l'ensemble des fragments produits pas une digestion doit vous reconstituer le plasmide natif. D'où vient le fragment de 8000 pb quand on parle d'un plasmide de 4300 pb.  [...] Je me base à la graduation donnée par un marqueur de taille Smartladder Eurogentec qui contient des fragments de 200 400 600 800 1000 1500 2000 2500 3000 4000 5000 6000 8000 10000. Je suis parti du fait que la marque 10000pb est celle la plus proche des puits de dépot (ai-je bien fait).  [...]

[L1 BIO] TP Biologie moléculaire

La digestion te donne des fragments d'ADN. L'electrophorèse les classe selon leur taille. Le résultat du gel d'electrophorèse te donne donc seulement des bandes, chaque bande correspond à des fragments de plasmides d'une taille donnée.  [...] Tu en déduis qu'il y a eu 5 fragments issus de ta digestion donc 5 sites sur ton plasmides, séparés par 100, 600, 700, 800pb et encore 800pb... Mais ça ne te donne pas l'ordre selon lequel ils sont placés les uns par rapport aux autres... Tu n'as donc toujours pas la carte de ton plasmide avec cette simple information.  [...]

TP sur les plasmides

On a comme modèle de référence donc un plasmide de type afa-3 d'E. coli. On a fait une simulation de digestion de ce plasmide, ce qui nous a donné plusieurs fragments de plasmide.  [...] Sur nos souches A,B et X on a extrait les plasmides, l'enzyme Pst1 les a digérée au niveau des gènes qui codent pour l'adhésine puis on a fait une électrophorèse sur gel d'agarose (on a donc une migration des fragments d'ADN).  [...]

[Biologie Moléculaire] Enzyme de restriction

Alors j'ai un plasmide qui fait 5858 paires de base et on nous dit que l'enzyme de restriction EcoR1 coupe a 1,a 948 et a 1582.On me demande de calculer la taille des fragments obtenus apres digestion du plasmide par EcoR1.Je me demande s'il faut soustraire a chaque fois du nombre total de paires de base du plasmide,le nombre de paires de base que coupe EcoR1Sachant que j'obtiens 3 fragments pour ce plasmide si je ne me trompe pas.  [...] une derniere petite question parcontre,on me demande de calculer aussi les fragments attendus dans le cas ou ou il y a plusieurs sites EcoR1 et ou la digestion serait incomplete.Je ne trouve pas cette question tres claire,donc je ne vois pas trop comment faire.  [...]

clonage qui ne fonctionne pas ? ratio ?

Voici brievement le protocole, digestion du plasmide par une enzyme qui génere des extrémités cohésives (pacI), puis purification des deux fragments à partir d'un gel d'agarose QIAEXII.  [...] C'est vrai que sur gel apres digestion les inserts sont assez faible par rapport au reste de plasmide, est ce que le fait d'augmenter le temps de digestion pourrai augmenter mon taux d'insert.  [...]