• Santé - Forme, Lavages, Anticorps, Marques

[Biochimie] Elisa

Une autre petite question. le probleme avec la BSA, c'est qu'elle forme des sortes d'aggrégats qui ne sont pas éliminés par les lavages et dans lesquels les anticorps marqués viennent se coincer, c'est bien cela.  [...] Sinon, pour finir quelqu'un aurait-il un protocole de dosage ELISA indirect ac marqués biotine + streptavidine-peroxydase Merci.  [...]

[Biologie Cellulaire] Marquage par Ac-FITC : du solide ?

Après la période d'incubation, j'aurais ajouté un anticorps anti-[protéine récherchée]. puis un second anticorps marqué au FITC et dirigé contre l'anticorps du complexe précédent.  [...] Lors d'une assistance à une thèse sur le biofilm marqué au FITC, on ne faisait que 3 lavages consécutives après 2h d'incubation et 22h d'incubation, lavage au PBS, donc je ne vois pas le problème si tu souhaite éliminer l'excès d'anticorps par ce moyen (enfin on utilisais des lectines nous, pas des anticorps ^^).  [...]

[Biologie Moléculaire] In situ

Je fais mon hybridations à 65 C O/N puis des lavages à 65C 2 fois, et des lavages au conditions RT 3 fois, je mets la solution de blocking reagments pendants 1 hrs, puis j'ajoute l'anticorps O/N ensuite les lavages et l'anticorps secondaire,  [...] J'ai seulement du non spécifique et des petites points qui sont partout de façons aléatoire, j'en ai fait aussi avec l'anticorps anti-DIG alkaline phosphatase et j'avais encore le non spécifique. Je n'ai pas encore essayer de faire avec une nouvelle sonde merci pour votre aide je vais aussi changer la température de mes lavages, mais est-ce que vous pensez que je dois refaire aussi les solutions pour l'hybridation et le lavage.  [...]

[Biochimie] Détection au cytométre de Flux

Enfin, les cellules ont été lavées après incubation avec l'anticorps, 3 lavages successifs au PBS BSA + centrifugation à chaque fois.  [...] Le décalage des témoins me paraissait trop important pour être seulement du à la transfection. D'après ce qu'on a pu me dire, ce décalage serait en fait du aux anticorps qui se fixent de manière non spécifique à des récepteurs Fc. Ce qui induirait une fluorescence supplémentaire.  [...]

[Biologie Cellulaire] monocyte et immunofluorescence

et on utilisait des cellules adhérentes, ce qui permettait de faire des lavages (excès d' anticorps).  [...] Pour les cellules non adhérentes, on utilise la méthode du cytospin qui consiste à centrifuger les cellules avec au fond une lamelle. On centrifuge à 7000g environ pendant 10 minutes, avec la force centrifuge les cellules se plaquent sur la lamelle, on peut ainsi fixer ces cellules au paraformaldehyde puis réaliser les étapes suivantes d'une immunofluorescence.  [...]

[Biologie Cellulaire] Qui à déjà utilisé le système SNAP i.d. de Millipore pour ses Western Blot?

Une representante de millipore m'a présenté le système SNAP i.d. qui me permettrait de faire le blocage de la membrane, l'incubation avec l'anticorps primaire, les lavages et l'incubation avec l'anticorps secondaires de mes WB en une demi heure... Ce qui est très interessant etant donné que ça me ferait gagner une journée à chaque WB.  [...] Nous l'avions demandé en prêt avant de l'acheter. Je vous suggère de faire pareil. Ainsi, cela vous permettra de tester vos anticorps et d'être surs que cela fonctionne dans vos mains.  [...]

Matériels et méthodes | Dossier

La membrane est ensuite lavée 2 fois 10 minutes avant de mettre l'anticorps secondaire de singe (TEBU) dirigé contre les chaînes lourdes et légères des anticorps primaires et marqué à la peroxydase. Cet anticorps est dilué 1000 fois dans le même tampon que l'anticorps primaire, cette étape se fait pendant 45 minutes à température ambiante.  [...] Il est basé sur la compétition entre du thromboxane B2 non marqué présent dans le milieu et une quantité fixée de thromboxane marqué à l'iode 125. Il est ajouté un anticorps primaire qui a une haute affinité et spécificité pour le thromboxane B 2. Avec une quantité fixée d'anticorps et de ligand radioactif, la quantité de ligand radioactif lié reconnue par l'anticorps est inversement proportionnelle à la concentration de ligand non marqué additionné.  [...]

[Biologie Cellulaire] Co-Immunoprécipitation

donc que B interagit avec A. Pour controler, tu reincubera la membrane avec un anticorps anti A pour vérifier la présence de la protéine A (sinon cela signifie que ton IP n'a pas marché, donc il est normal que tu ne vois pas B).  [...] Tu peux aussi immunoprécipiter avec un anticorps anti C (autre protéine connu pour ne pas interagir avec A ni B), et vérifier la présence de A ou B. Si tu détectes A ou B, cela signifie que tu as une fixation aspecifique de ta protéine sur les billes, que tes lavages n'étaient pas bons.  [...]

[Biochimie] bruit de fond western blot

Sachant que je laisse incuber l'anticorps primaire 1 nuit à 4°C, et que je fais une dizaine de lavages de 5 min au TBST avant l'anticorps secondaire... Comment puis-je améliorer la technique.  [...] Mouais, Santa Cruz et les anticorps... mais ce qui est bien chez eux en général c'est que si l'anticorps ne fonctionne pas tu peux te le faire rembourser ou bien ils t'envoient un autre clone gratuitement.  [...]

Matériels et méthodes | Dossier

Cette membrane est incubée pendant 1,5 heure avec une solution pour western blot (cf. annexe 1) contenant du lait à la concentration de 10 %, ceci permettra d'éviter des liaisons non spécifiques des anticorps utilisés par la suite. La solution pour western blot est ensuite employée pour laver la membrane 4 fois 10 minutes.  [...] La membrane est ensuite lavée 4 fois 10 minutes avant de mettre l'anticorps secondaire de singe (Nordic), marqué à la peroxydase, et qui est dirigé contre les chaînes lourdes et légères des anticorps primaires. Il est dilué 10 000 fois dans le même tampon que l'anticorps primaire, cette étape se fait pendant 45 minutes à température ambiante.  [...]