• Santé - Expression, Protéine, Vecteur

Expression de protéines

J'ai fait une expression de protéine taguée Histidine contenue dans un vecteur d'expression pTrcHis2B (protéine de Plasmodium falciparum ) dans des bactéries d'expression Rosetta 2, seulement lors de l'extraction de cette protéine puis dépôt sur gel j'ai 2 tailles différentes de cette même protéine.  [...] Si tu es certain que les deux bandes correspondent à ta protéine (la mass spec est de loin la méthode la plus fiable, bien plus qu'un WB), tu as probablement eu une protéolyse spontanée. Il faudrait savoir si ta bande de plus haut poids correspond à la masse attendue pour ta protéine, auquel cas tu aurais de la protéine intacte en fraction soluble et de la protéine clivée en fraction insoluble.  [...]

[Biologie Moléculaire] Expression hétérologue de protéine : vecteur baculoviral

.. J'ai décidé de rester chez coli parce que les essais préliminaires d'expression de cette protéine mais avec un tag MBP (j'utilise hexa-His) ont été concluants.  [...] 107 kDa, c'est très gros pour une expression en bactérie. Parfois ça marche mais en général ça finit en corps d'inclusion ou en protéine non exprimée. Le passage en baculovirus me semble inévitable dans ton cas.  [...]

[Biochimie] Vecteur d'expression pour une proteine recombinante

J'ai besoin d'aide pour une question dans un exercice portant sur la construction d'un vecteur d'expression pour une proteine recombinante.  [...] Pour produire cette proteine de fusion dans les cellules de souris, il faut donc assembler un ADN recombinant puis de l'insérer dans un plasmide (ou vecteur ) d'expression permettant la transcription puis la traduction dans les cellules. Au préalable, afin de disposer de suffisamment de vecteur pour les cellules de souris, il est necessaire d'amplifier le vecteur dans le collibacille.  [...]

Protéine recombinante, promoteurs du vecteur d'expression

2/ On choisit un promoteur inductible. Si j'ai bien compris son interet est de pouvoir réguler la synthèse de la protéine en fonction de l'activité de la bactérie. Par exemple si la protéine synthétisé est toxique pour la bactérie on va chercher à ne pas la produire lors de la phase de multiplication bactérienne et lancer la production lors de la phase stationnaire.  [...] Et même si ce n'est pas toxique, il vaut mieux induire à la fin, on a de meileurs rendements car la pousse n'est pas ralentie à cause d'une protéine surproduite et une meilleure gestion des nutriments.  [...]

Protéine de fusion recombinante dimérique, besoin d'aide.

C'est un vecteur d'expression pour la proinsuline et l'écotine. Et dans l'énoncé, il est noté que l'écotine est une protéine dimérique. Du coup, je pensais qu'il fallait faire deux plasmides. Un avec la proinsuline et l'écotine et un autre juste avec l'écotine.  [...] Si l'écotine se dimérise, il suffit de faire un seul vecteur avec un gène fusionnant écotine et proinsuline, et la dimérisation de cette protéine de fusion se fera spontanément via le domaine écotine.  [...]

[Biologie Moléculaire] Protéine de fusion

En fait on utilise ces protéines de fusion pour faciliter la purification de la protéine et son couplage ultérieur à autre chose pour de la vectorisation. En général c'est juste le domaine Fc qui est pris dans la protéine de fusion, si tu veux en savoir plus envoie moi un MP.  [...] et j'ajouterai que le fragment Fc permet d'augmenter le poids moléculaire de la protéine, évitant son élimination rapide par le rein et en favorisant son recyclage vers la circulation sanguine via des récepteurs aux fragment Fc présents quelque part au niveau du néphron.  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème vecteur d'expression CDC25

Pour cela je dois faire une protéine de fusion, j'ai pensé a la GST mais je cherche comment l'exprimer, j'ai choisi E.coli, est-ce une bonne idée.  [...] Mais je suis bloqué pour l'expression de la protéine, je ne sais pas quel vecteur d'expression, producteur inductible ni enzyme de restriction prendre. J'ai regardé sur clonetech pour le vecteur mais je ne sais pas pourquoi choisir un vecteur et pas l'autre.  [...]

[biologie moléculaire] Probleme expression apres transfection stable

J'ai réalisé une construction en vue de l'expression d'une protéine en stable par des cellules HeLa. Le vecteur utilisé est le pIREShyg3, qui comme son nom l'indique contient.  [...] La construction a bien marché, le séquençage est OK, les cellules transfectées résistent à l'hygromycine (pas les cellules non transfectées contrôle), mais pas de trace de notre protéine, rien. alors que l'expression est importante avec un vecteur pCMV en transitoire.  [...]

[Biologie Moléculaire] augmentation du taux d'ARN mais non celui de la protéine

Je ne l'ai jamais fais donc je ne sais pas si ca fonctionne bien mais une astuce pour faire le tri serait d'utiliser un ARNi/morpholino antisens à ton ARNm pour faire un IHC sur tes cellules mutantes pour ta protéine. Le contrôle d'inhibition de l'expression de l'ARN endogène serait un northern ou une qPCR.  [...] Le phénomène se reproduit il dans une autre lignée Que se passe t il lors de la transfection avec un vecteur d'expression pour cette protéine.  [...]

[Biologie Cellulaire] Fluorescence en tissus fixés

J'utilise un vecteur adénoviral pour exprimer une protéine dans le foie de souriceaux. Ce vecteur permet aussi l'expression de la GFP. Comme je fais des coupes pour l'histo, je me demandais si je ne pouvais pas en profiter pour vérifier la topographie de l'infection en regardant la fluorescence de la GFP.  [...] Question. la gfp reste-t-elle fonctionnelle apres fixation des coupes (PFA 4%) Sur la dernière série je n'ai rien vu mais les tissus avaient quand même souffert.   [...]