• Santé - Expression, Plasmide, Cellules

[Biologie Moléculaire] D'une protéine à un gène à une protéine

En d'autres mots et via un exemple, est-il possible de copier un anticorps monoclonal si l'on ne dipose pas de cellules productrices (mais bien de la protéine/anticorps en question et en quantité suffisante).  [...] Ensuite, si tu as besoin de modifications post-traductionnelles (glycosylation, formation de ponts disulfure) tu peux mettre ce gène dans un plasmide d'expression eucaryotique, et faire de l'expression dans des cellules CHO, par exemple.  [...]

[Divers] Interprétation d'un article: question sur les cellules HEK293

En effet ça aurait été bien qu'ils mettent un western sur TLR2 et CEACAM1 avant transfection, au moins pour montrer que la transfection permet bien d'augmenter le niveau d'expression de ces protéines (si elles sont exprimées). Si les auteurs ne se servent que de la surexpression de ces protéines pour étudier des phénotypes particuliers, il n'y a pas de problème majeur à ce qu'on ne connaisse pas le niveau d'expression basal de ces deux protéines, dans le cas où elles sont exprimées.  [...] Si on ne transfecte pas les cellules elles ne répondent pas. Si on transfecte avec un plasmide d'expression TLR2, elles répondent. C'est bien la preuve que c'est TLR2 qui médie la réponse. De plus, si il avait déjà été présent dans les cellules alors les cellules non transfectées auraient répondues.  [...]

[Biologie Moléculaire] "Vectorologie" : le cPPT ?

Dans le vecteur permettant l'expression du plasmide dans les cellules eucaryotes (alternativement il sert aussi à la production des particules), il y a juste après le site d'insertion du shRNA un site appelé cPPT pour central Polypurine Tract.  [...] A retroviral RNA genome contains short stretches of purines, called polypurine tracts (PPTs), near the 32-end. These PPTs function as RNA primers for plus-strand DNA synthesis during reverse transcription. Complex retroviruses (including HIV-1) contain a second, more centrally located PPT that provides a second site for initiation of DNA synthesis.   [...]

[Génétique] Tale nuclease

Bonjour, je voudrais savoir svp si quelqu'un aurais déjà entendu parler des TALENS ces des enzymes artificielles qui provoquent des cassures double brin de l'ADN je souhaite savoir si en les transfectant grce à un plasmide dans une cellules eucaryotes il faut que ce gène s'intègre a l'ADN de la cellules eucaryotes ou une simple expression transitoire suffit, Merci bcp d'avance.  [...]

Pureté de l'ADN / efficacité d'expression

J'utilise un protocole de transfection par électroporation sur des cellules HEK293/COS-7, à l'aide d'ADN plasmidiques obtenus de maxi-preps. Le rapport A260/A280 est rarement de 1,8 (l'idéal), plus souvent autour de 1,6 - 1,7.  [...] pour ce qui est de la pureté de ton ADN pour les transfections, si tu tourne autour de 1,6-1,7 c'est vraiment bien. Pour être honnête, moi j'avais une prép de plasmide qui tournait plutôt autour des 1,4-1,5 et mes transfections sur cellules marchaient très bien, y compris le taux d'expression de la protéine qui convenait pour mon type de manip.  [...]

[Biotechnologie] Tp rt-pcr

Au pire il est toujours possible de bricoler un plasmide d'expression avec votre gène tronqué et de transformer vos cellules avec. Même sans le dire aux étudiants qui découvriront des transcrits de plusieurs tailles dans leurs extraits.  [...] b'en le problème c'est que je n'ai pas de lignée cellulaire ni de bactérie, donc je pars un peu de zéro. tout ce dont j'aurai besoin devra être chiné à gauche et à droite dans les labos autour du notre (laboratoire de formation pour adulte)...c'est pour ça je pense que j'ai du mal à trouver un sujet de départ.  [...]

[Génétique] exprimer une protéine dans E.COLI

Mais, tu va devoir modifier ton transcrit d'ADN c de départ pour par exemple utiliser les ARNt que la bactérie utilise le plus souvent, et aussi, tu peux, par PCR, ajouter une séquence à ton plasmide permettant de secréter la protéine dans l'espace périplasmique ou extracellulaire.  [...] il n'y a pas de plasmide replicatif pour les cellules de mammiferes. Au moins tu fais de l'expression transitoire, sinon tu utilises des vecteurs viraux.  [...]

Transformation/inativation d'un gène

Chez les cellules de mammifères normales il n'y a pas de plasmide et pourtant tu peux très bien faire de l'expression plasmidique.  [...] Ok, don si j'ai bien compris je construis mon plasmide avec les extrémités du mon gène a déléter, plus un gène de sélection, et après il faut transfecter ce plasmide donc le champignon.  [...]

[Biologie Moléculaire] problemes de digestion de plasmides

j'utilise un plasmide pET 28a pour faire un clonage chez coli mais les différente digestion de ce ce plasmide par EcoR1 Hind3 Xba1 Kpn1 incuber plus ou moins longtemps ne me permette pas d obtenir une digestion correcte. quelqu un a déjà eu ce genre de résultats comment y palier comment l'interpréter.  [...] J'utilisais le même plasmide (et les mêmes cellules d'expression ).  [...]

[Biochimie] nouvelle sur le forum et besoin de vs pour du clonage, help

J'imagine que vous êtes bien conscient(e) que l'intérêt de ce plasmide est de faire de l'expression dans des cellules eucaryotes.  [...] Sinon, oui c'est possible mais ce sera un peu plus compliqué. Ce qui change c'est que vous n'êtes plus en AT ou GC cloning ce qui signifie qu'il va vous falloir faire des digestions de restriction (bon choix des enzymes, quelques tests et purifs en plus) et surtout tenir compte de la phase (si vous souhaitez réellement faire de l'expression).  [...]