• Santé - Expression, Cellules, Mammifères

Transformation/inativation d'un gène

Chez les cellules de mammifères normales il n'y a pas de plasmide et pourtant tu peux très bien faire de l'expression plasmidique.  [...] Ok, don si j'ai bien compris je construis mon plasmide avec les extrémités du mon gène a déléter, plus un gène de sélection, et après il faut transfecter ce plasmide donc le champignon.   [...]

[Génétique] exprimer une protéine dans E.COLI

il n'y a pas de plasmide replicatif pour les cellules de mammiferes. Au moins tu fais de l'expression transitoire, sinon tu utilises des vecteurs viraux.  [...] A propos des corps d'inclusion, j'ai ecrit dans mon cours que pour les éviter il fallait diminuer le taux d'expression des protéines, et ensuite j'ai noté qu'il fallait augment la synthèse des protéines subissant un remodelage avec les protéines chaperons.  [...]

[Biotechnologie] Clonage Eucaryote

Concernant le clonage de cellules eucaryotes, est ce possible qu'une cellule de mammifère accepte un plasmide et le réplique comme il faut ou ce plasmide (contenant le gène étranger) doit il absolument être intégré au génome cellulaires.  [...] L'expression transitoire consiste a faire rentrer une molecule d'ADN en sachant que celle-ci ne sera pas repliquer, mais comme les cellules de mammiferes se multiplient doucement, l'effet de dilution n'est pas super important.  [...]

[Biologie Moléculaire] amplification: PCR vs plasmides

Dans notre expérience (expression d'amylase par des cellules mammifères qui ne l'expriment pas), on a récupéré le cDNA, amplifié par PCR, puis insérer dans des plasmides, inséré dans des E.Coli et amplifié. Pourquoi l'amplification pas PCR n'a pas suffit.  [...] - être précédé d'un promoteur (CMV, RSV ou SV40 par exemple), qui permettra à la RNA Polymérase II de tes cellules de s'accrocher à ton cDNA pour initier sa transcription en mRNA.  [...]

[Biologie Moléculaire] mutagènese, transformation, transfection

La suite est un peu plus floue, je reconstruit. Vous avez fait votre mutagénèse en bluescript (vecteur de clonage). Vous souhaitez exprimer votre insert dans des cellules de mammifères. Il vous faut donc un vecteur d'expression eucaryote. Du coup le transfert Bluescript -.  [...] Tu as 2 transformations distinctes en fait. Une première, avec les bactéries, qui te sert à amplifier le plasmide et réaliser la mutagenèse dirigée. Ensuite, tu récupère ton bluescript et tu transfert dans le vecteur POZ. Ensuite, tu transformes des cellules eucaryotes avec le vecteur POZ.  [...]

[Microbiologie] levures

L'utilisation des levures en recherche est assez vaste. On retrouve souvent l'expression de Levure, Modèle et Outil. Modèle car elles peuvent servir à l'étude de bcp de mécanismes biologiques. cycle cellulaire, réponse au stress. etc... En fait, bien que ce soit un organisme unicellulaire, c'est un eucaryote supérieur et beaucoup des mécanismes biologiques sont proches des mécanismes de cellules de mammifères.  [...] Autant pour moi... Comme je l'ai dit, je ne suis pas microbiologiste et n'y connais pas grand chose dans ces classifications... Je n'ai fait que citer ce que j'avais lu dans un bouquin... Donc merci pour la précision... Mais je crains une chose du coup, c'est que notre discussion n'ait fait qu'embrouiller Dradra dans ses pensées.   [...]

[Biologie Moléculaire] Expression hétérologue de protéine : vecteur baculoviral

* j'ai vu que l'expression chez la levure n'est pas super avantageuse à cause de problèmes de repliements, donc j'ai décidé d'opter pour les baculovirus et les cellules de droso. Mais je ne sais pas ce qui est mieux. ça ou carrément des cellules de Mammifères (je suis dans un labo de microbio ).  [...] Oui ce sont des cellules de mammifères transformées avec un retrovirus. Le retrovirus étant lui même produit à partir de cellules un peu spéciales (je n'entre pas dans le détail) elles mêmes transformées avec un vecteur retroviral modifié.  [...]

[Journal club] Extinction de l'expression de gènes par les siRNA : la découverte

découverte de l'épissage), a eu la brillante idée d'introduire directement des petits ARN interférents (siRNA) dans les cellules de mammifères en culture pour induire l'extinction (knock-down) de gènes cibles. Cela avait été montré chez d'autres espèces avec des ARN double brin (dsRNA), mais les tentatives étaient vouées à l'échec chez les mammifères.  [...] La taille des ARN interférents est donc la clé de la réussite d'une extinction très spécifique des gènes rapporteurs dans les cellules de mammifères sans affecter l'expression des autres gènes.  [...]

influence des peptides signaux sur la sécrétion des protéines

2 mg/ml, ça me semble déjà pas mal en cellules de mammifères. Peut-etre que tu as une proteine naturellement difficile à replier (protéine de plus de 40 à 50 kDa, beaucoup de ponts disulfures, peu de structures secondaires,... ) et que quelque soit le peptide signal que tu rajoutes, tu arriveras à une expression assez faible de toute façon.  [...] Mais à 2 mg/ml, tu peux déjà quasiment tout faire ce que tu veux, même si c'est assez fastidieux en cellules de mammifères (2 mg/ml en cellules de mammifères, j'ai déjà donné et c'est vrai que c'est rapidement lourd). A la rigueur, ça peut valoir le coup de tenter en baculovirus, la production sera meilleure, mais il y a un risque d'aggrégation dans le cas d'une glycoprotéine.  [...]

La régénération des salamandres imitée chez la souris !

Ils ont cherché à éteindre l'expression des deux gènes, Rb et Arf, simultanément dans des cellules de mammifères, imitant l'état d'une cellule musculaire de salamandre en pleine régénération.  [...] Pour stopper l'expression des gènes, ils ont utilisé la technique d'ARN interférence sur des cellules musculaires de souris en culture. L' extinction spécifique des deux gènes a été réalisée transitoirement, laissant le temps à ces cellules (qui sont normalement incapables de se diviser) de commencer à proliférer.  [...]