• Santé - étape, Tampon, Cellules

[Biochimie] Protocole fractionnement : isoler le cytoplasme et le noyau

Je te précise quand même deux ou trois choses. le truc important, c'est d'arriver a l'étape ou tu mets le tampon hypotonique sur tes cellules sans les abimer. A ce moment, on fragilise la membrane plasmique qui libère le cytoplasme, et donc pour avoir une bonne séparation, il faut absolument réussir a décoller et a rincer les cellules sans trop les malmener.  [...] oui il fonctionne très bien, il suffit a la premiere étape de centrifuger les cellules, d'aspirer le milieu et de procéder a la seconde étape.  [...]

[Biologie Cellulaire] Mesure de l'activité d'exocytose de la HRP chez l'amibe (Niveau L2)

Lors d'un TP de biologie cellulaire nous avons mesuré l'activité d'ENDOCYTOSE de la HRP par l'amibe en faisant un suivi spectrométrique de la HRP des cellules d'amibe préalablement lavés, centrifugés, lysés en y ajoutant le substrat de la HRP. le TMB.  [...] Ton protocole est tout à fait juste. Peut-être une petite étape de lavage à 4°C avant de les suspendres dans ton tampon d'exocytose afin d'éliminer des HRP qui serait associées de manière non spécifique aux cellules. (Et à 4°C pour bloquer l'exocytose afin de ne pas démarrer l'exocytose avant le lavage).  [...]

extraction ADN et tampon phosphate

Bonjour à tous, si on veut extraire de l'ADN des cellules, une des premières étapes est de prendre ces cellules auxquelles on ajoute un tampon phosphate et des les centrifuger. J'aurais voulu savoir à quoi servait ce tampon phosphate merci d'avance.  [...] C'est surtout pour conserver des conditions physiologiques en terme de concentrations ioniques je pense.   [...]

[Biologie Moléculaire] Extraction d'ARN

-Précautions de base quand tu veux bosser avec de l'ARN, enfin je penses que tu sais déjà ca. instruments et réactifs RNAse free, garder au max les cellules au froid tant que t'es pas dans un milieu (eg trizol) adequat pour éviter la dégradation de l'ARN.  [...] Vous rajoutez une étape (non nécessaire selon moi) qui constitue une occasion supplémentaire de perdre du matériel. Vous devriez essayer de lyser le culot de cellules dans le tampon fourni et de suivre le protocole, si ça se trouve le problème sera résolu.  [...]

[Biochimie] tampon de lyse

juste une petite question, je travaille sur des cellules 293-t et lorsque je lyse certaines protéines restent insolubles, quelqu'un aurait-il une idée pour un tampon amélioré qui me permettrait de solubiliser ces protéines en vu du western.  [...] Qu'est ce qui te fait dire que tes protéines d'intérêt ne sont pas solubilisées par le tampon de lyse Les protéines que tu regardes sont-elles membranaires, localisées dans un sous-compartiment cellulaire particulier, les surexprimes-tu Comment lyses-tu tes cellules (composition tampon, étapes physiques de lyse (choc thermique, piston Dounce, vortex, sonication,...)).  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème : oublié centri sur cellules dans tampon de lyse => WB????

j'ai essayé de résumer mon pb dans le titre. En fait j'ai mis mes cellules adhérentes dans du tampon de lyse pour immunoprécipitation, mais j'ai oublié la centrifugation et je n'ai donc pas récupérer les membranes et noyaux. Donc là j'ai ajouté mon sample buffer mais biensur j'ai ma fraction qui est trop visqueuse pour être déposée en blot. que dois je faire pour pouvoir déposer.  [...] D'autre part, la viscosité peut-être éliminée en chauffant. ce qui rend l'extrait visqueux c'est le DNA essentiellement. Après le problème peut aussi venir de la quantité de cellules que tu as lysé.  [...]

Comment gérer cette situation en stage?

Malheureusement, j'ai utilisé le mauvais tampon pour les cellules (apparemment pas adapté pour les LT) alors que dans la précipitation, en m'expliquant tout le truc super vite, elle m'avait bien dit d'utiliser ce tampon.  [...] Ah oui j'ai oublié de préciser que mercredi matin elle est venue me dire bonjour et me dire qu'à cause du tampon (le mauvais), toutes les cellules étaient mortes. (d'ou les remarques qui m'ont un peu contrarié).  [...]

Matériels et méthodes | Dossier

Les cellules sont prélevées sur héparinate de lithium à partir de sang de volontaires sains. Le sang est dilué au demi dans un tampon Na 2 HPO 4 (PBS) à 0,1 M et à pH 7,4. Au fond de chaque tube, 10 ml d'Histopaque-1077 (Sigma) sont déposés. Après une centrifugation à 400g pendant 30 minutes à température ambiante, les monocytes et les lymphocytes, se trouvant à l'interface plasma-Histopaque, sont récupérés dans un tube à part et mis à centrifuger à 400g pendant 10 minutes, ensuite ils sont mis dans un tampon Hanks' HEPES et conservés à 4°C avant leur utilisation.  [...] Les molécules originales sont insolubles dans l'eau, dans le tampon (Hanks'HEPES) utilisé pour l'incubation des cellules et dans les solvants organiques compatibles avec une non toxicité vis à vis des monocytes, lymphocytes. Les composés sont tout d'abord dissout dans une substance solubilisante.  [...]

Matériels et méthodes | Dossier

Après une centrifugation à 400 g pendant 10 minutes à 4°C, les granulocytes sont remis en suspension dans le tampon de lyse de chromatographie (cf. annexe 1) à la concentration de 50.10 6 cellules/ml et à raison de 25.10 6 cellules par tube. Les cellules sont lysées par sonication, à raison 6 fois 5 secondes en prenant garde à bien refroidir les tubes entre chacune des phases de sonication pour éviter une dénaturation trop importante de l'enzyme.  [...] Les cellules sont remises en suspension dans le tampon de lyse pour western blot (cf. annexe 1) à la concentration de 50.10 6 cellules /ml. Elles sont soniquées 6 fois 5 secondes, en refroidissant les tubes entre chaque passage. Les milieux sont centrifugés à 8000 g pendant 5 minutes à 4°C pour éliminer les noyaux et les cellules non lysées.  [...]

[Biologie Moléculaire] PCR après tri cellulaire au FACS

je souhaite réaliser un génotypage cellules spécifiques. Je vais donc marquer et trier des cellules au FACS, puis je réaliserai une PCR sur les cellules récupérées. Je voulais savoir dans quel tampon il était préférable de reprendre mes cellules pour réaliser la PCR à la suite.  [...] Le même tampon que celui du tri, puis tu centrifuge tes cellules et tu fais un culot sec si tu veux les stocker à -80 ou alors tu fais directement la lyse puis l'extraction d'ADN.  [...]