• Santé - étape, Révélation, Western

[Biochimie] dot plot et overlay

Dans le but d'étudier les interactions entre 2 protéines, je voudrais faire un dot plot pour immobiliser ma première protéine sur la membrane de nitrocellulose, par la suite je voudrais faire un overlay ou j'incube ma membrane de nitrocellulose dans la solution de la deuxième protéine et je révèle les interactions par l'anticorps de la deuxième protéine.   [...] J'ai cherché un protocole pour faire cette technique cependant je n'ai pas trouvé un protocole complet qui comporte le dot plot et l'overlay surtout que ceux qui font l'overlay commence par faire un western blot alors que moi j'évite de le faire pour ne pas dénaturer mes protéines.  [...]

gel shift : hhhheeeeelllp !!!!!!!

Je te recommande le kit de Roche DIG gel shift kit. J'ai eu a l'utiliser pendant ma these, le marquage se fait par la digoxigenine et la revelation est de type western blot. C'est un kit clef en main, c'est a dire que tu as tous les tampons pour faire ton shift de la permiere a la derniere etape.  [...] je pose cette question car dans le cas de l'utilisation du kit dont je parlais la derneiere fois, on ne peut pas réaliser d'expérineces de compétition car c le gel qui est coloré apres l'electrophorese et il n'y a pas de marquage de sonde d'ADN, donc je ne vois pas pourquoi l'interaction ADN/prot serait non spécifique dans ce cas.   [...]

Problème de WB, HRP sensible à la lumière ?

Je n'ai jamais entendu que l'AC secondaire couplé à la HRP était sensible à la lumière, et quand je faisais des western blot je ne réalisais que l'étape de révélation à l'obscurité.  [...] Merci pour vos réponses. C'est bien ce que je pensais, c'est seulement les solutions de révélation qui doivent être protégée de la lumière.  [...]

[Biochimie] bandes parasites aprés révélation western-blot

j'aimerais savoir si quelqu'un à l'habitude de réaliser des immunoprécipitations avec révélation de la protéine d'intérêt en western blot.  [...] apré révélation du blot à l'opti 4CN (biorad) je retrouve bien ma protéine d'intérêt (IP fonctionne) ainsi que la bande haute et basse de mon Ac spécifique de ma protéine, mais si je laisse le blot révélé plus longtemps, je vois apparaitre d'autres bandes autour de celles de l'Ac (révélation du blot ~2min) ces bandes sont elles dû à un mauvais blocage de la membrane utilisation d'un Ac-HRP polyclonal comme Ac secondaire.  [...]

[Biologie Moléculaire] western blot "semi-quantitatif", pourquoi??

J'utilise la technique du western blot afin de quantifier mes protéines d'intérêt (par chemiluminescence, révélation par l'ECL+ et analyseur d'image permettant de quantifier mes blots), mais une question se pose à moi. pourquoi dit-on du western blot que c'est une technique semi-quantitative Quelles sont les limites de la quantification.  [...] Ensuite, quand on fait une quantification par rapport à une référence, si on utilise des anticorps avec des affinités trop différentes pour leur cible, c'est comme pour la PCR quantitative relative, on introduit un biais. un différence entre 2 quantités visible avec un anticorps risque de ne pas l'être avec le 2ème anticorps (surtout si on utilise des expositions sur des films distincts pour les 2 anticorps, avec des temps d'exposition différents, etc...).   [...]

Second messagers

-l'IP3 soluble (et le DAG) formés par la phospho lipase C. Si c'est la PLC bêta, elle est activée par G alpha q, ou éventuellement bêta/gamma. Si c'est la PLC gamma, il peut-y avoir activation par une récept tyrosine kinase, un LAT (dans les lymphocytes).   [...] Bon je vais essayer de me connecter régulièrement aujourd'hui mais sans garentie car j'ai beaucoup de boulot (révélation de Western entre autre, sur l'activité Erk puisqu'on en parle... ).  [...]

[Génétique] comment savoir qu'un gène est sous silence

bonjour, J'ai un peu de mal à savoir comment on peut vérifier qu'un gène est bien mis sous silence. Je connais 2 méthodes pour cela.   [...] - induire la traduction puis réaliser un Western blot avec un anticorps, si il n'y a aucune révélation c'est qu'il n'y a pas de protéine et donc que le gène est sous silence.  [...]

[Biologie Moléculaire] Western et révélation bandes

Le but de ce western est de localisé la ferroportine en comparant deux gels polyacrylamide. La migration de chaque échantillon étant réalisée dans 1 cas avec des protéines extraites de cellules non traités et dans l'autres cas avec des échantillons traités à l'hepcidine.  [...] Mon problème est d'un part la révélation, en effet on révèle par chémoluminescence car le gène de la ferroportine est couplé à la GFP (gène rapporteur et fluorescent naturel). Ce qui me pose pb c'est que l'on utilise un kit ECL après action d'un Anticorps II radioactif anti GFP alors qu'on pourrait détecter directement la GFP via excitation et émission (car il émet une lumière verte).  [...]

[Biochimie] Quantifier un western blot

Le western blot (semi)quantitatif on arrive à faire ça pour se se faire une idée mais dans le fond c'est quand même difficile de convaincre quelqu'un avec ça.  [...] C est comme un western blot normal, sauf que l'anticorps secondaire est un peu spécial. L'inconvenant, c est sue la révélation se fait grâce à un scanner spécial (scanner infrarouge) quidoit couter assez cher.  [...]

[Biologie Moléculaire] Phosphor-screens

Pour ce faire on fait réagir la MAP Kinase avec H1 en présence de phosphate radioactif, on stoppe la réaction, on effectue une électrophorèse dont les gels sont ensuite exposés aux fameux phosphor-screens. Ensuite il est littéralement écrit. The phosphor-images of gels (screens) were captured and the kinase activity was quantified using an FX phosphor image analysis system.   [...] Les phosphor-screens (je ne connais pas le nom Français s'il y en a un), permettent de capter la radioactivité du gel. Le principe est donc similaire à l'exposition d'un hyperfilm ECL avec une membrane de western blot qui émet de la luminescence. Une fois le phosphor-screen suffisamment exposé pour avoir un signal détectable, on le lit avec un appareil spécial qui s'appelle un PhosphorImager, qui remplace la développeuse ou la caméra CCD dans la révélation d'un western blot.  [...]