• Santé - étape, Concentration, ADN

demande d'infos!!! extraction de l'ADN

j'ai pas une question. plutot une demande... je ne sait pas si quelqu'un pourra m'envoyer un document complet concernant l'extraction de l'ADN, avec le principe de chaque étape, pourquoi chloroforme pourquoi phenol.  [...] L'extraction d'ADN est au programme au lycée en seconde, et c'est une manip qui est faite à la fac donc si dans google tu tapes TP extraction ADN tu devrais trouver ce que tu veux.  [...]

[Biologie Cellulaire] enzyme de restriction

Il est très possible de cloner un fragment d'ADN génomique amplifié par PCR dans un plasmide extrait mais non amplifié, mais il est préférable de déterminer la concentration approximative disponible de ces 2 olécules avant de les utiliser.  [...] Personnellement je n'ai jamais eut de probleme, mais je passe par une etape de purification sur colone ce qui me permet probablement de m'en debarasser (de la meme maniere que les fragments d'ADN clonés apres migration sur un gel d'agarose+BET. Ceci dit, il en faut vraiment pas bcp, car meme a tres faible concentration ca inhibe tres fort la digestion.  [...]

[Biologie Moléculaire] le gel idéal??

Je ne sais pas ce que tu veux faire avec ton ADN, mais si tu le quantifies A 260 il faut d'abord que tu degrades l'ARN et que tu repurifies l'ADN, sinon ta concentration va etre plus que fausse. Generalement dans les extractions old school il y a une etape de traitement a la RNase avant la precipitation.  [...] une de tes remarques m'a interpellée, lorsque dis que l'ADN génomique ne migre pas dans un gel à 0,8%, tu signifie qu'il faut une concentration moindre.  [...]

[Biologie Moléculaire] PCR et température d'hybridation

Cette étape (généralement 2 à 60 secondes à 56-64°C) permet aux amorces sens et anti-sens de s'hybrider aux ADN matrice grâce à une température qui leur est thermodynamiquement favorable. Peu de brins d'ADN matrice peuvent s'hybrider (se lier) avec leur brin complémentaire, ce qui empêcherait la fixation des amorces, car ces dernières sont bien plus courtes et en concentration bien plus importante.  [...] Expérimentalement, il est constaté que la PCR fonctionne même avec une phase d'hybridation avec une température supérieure de quelques degrés au Tm théorique des amorces, probablement parce qu'elles interagissent déjà avec les polymérases, qui stabiliseraient leur hybridation à l'ADN matrice.  [...]

[Biologie Moléculaire] travaux pratiques, isolation plasmide

L'éthanol 70% permet de faire précipiter l'ADN. On utilise d'abord de l'éthanol 96% (ou plus concentré) car on le rajoute en général à un volume de solution aqueuse qui contient l'ADN (souvent après une étape de phénol-chloroforme) et qui va diluer un peu l'éthanol.  [...] 1 µL d'enzyme ça ne veut pas dire grand chose... Il faudrait connaître la concentration de PstI et elle est écrite sur le tube normalement. La concentration des enzymes de restriction est souvent de 10 ou 20 (parfois 50) U/µL. U est l'abréviation pour unité (d'enzyme) et par définition, une unité permet de digérer 1 µg d'ADN en 1 heure à 37°C et dans un volume final de 50 µL.  [...]

[Biochimie] enzyme "détruite" à haute température?

On dérive hors-sujet... Rapidement pour que ce soit clair, la première étape de dénaturation de la PCR est bien plus longue (2-5 minutes à 95°C) que ce qui est nécessaire pour dénaturer l'ADN, 15-20 secondes à 95°C que l'on retrouve dans tous les cycles. La première étape est nécessaire pour activer les Hot Start qui ont l'avantage de ne pas être actives tant que cette étape n'est pas effectuée, elles ne dégradent donc pas les primers avec leur activité correctrice le temps de lancer la PCR.  [...] La dénaturation de l'ADN n'est pas le but de cette étape, il y a toujours une étape de ce type et qui sera répété lors du cycle même. Cette étape d'activation n'a lieu qu'une fois au début de la PCR.  [...]

[Biologie Moléculaire] lors de la purification de l'ADN plasmidique

je ne suis pas certains d'avoir compris. Si tu fais une lyse alcaline oui il y a une etape de phénol/chlorophorme suivi d'une précipitation de l'ADN.  [...] l'étape de phénol/chloroforme permet de faire précipités les débris cellulaire et les protéines pour s'en débarrasser. Cette étape est généralement suivie d'une étape de chloroforme pure qui permet de ce débarrasser d'éventuelles trace de phénol. Enfin, l'ADN est précipitée par un mélange éthanol 100% + sel, à froid.  [...]

apoptose cellulaire / fragmentation de l'ADN

Une partie de l'étude va être sur l'ADN fragmenté, sauf que sur le protocole que j'ai, à aucun moment il n'y a d'étape pouvant libérer l'ADN.  [...] Je pensais rajouter une étape SDS-HCl après la 1ère centri, mélanger doucement, centri et là récupérer le surnageant contenant l'ADN (si je ne me trompe pas) et faire migrer ça même si l'extrait n'est pas pur, je veux juste voir l'état de mon ADN.  [...]

[Biologie Moléculaire] Solution Q du kit Qiagen

Q-Solution facilitates amplification of difficult templates by modifying the melting behavior of DNA. Use of this unique reagent will often enable or improve suboptimal PCR (see figure Amplification of Difficult Templates with Q-Solution ). Unlike DMSO and other PCR additives, Q-Solution is used at a defined working concentration with any primer–template system and is not toxic.  [...] - Ensuite tu transfères ce surnageant sur la colonne de filtration. à l'aide de centrifugation et de différents lavages avec différents tampons (RPE, RW1) tu filtres ton surnageant. Les ARN restent accrocher sur la colonne.   [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage

le programme classique de PCR ne marchant pas, il a été modifié (étape d'hybridation passé de 52 à 50°C) c'est avec ce changement+ des variations de quantité d'ADN que j'ai réussi a obtenir 1-2 fois un très léger signal (sur gel agarose 1%+BEt), mais depuis plus rien, tout a été testé (augmentation du temps d'élongation, des concentrations en ADN, passage de l'étape d'hybridation a 50 et 45°C durant 2min et température augmentée, TA cloning) je suis donc dans une impasse puisque je n'arrive pas a obtenir cet insert, donc si vous avez des idées je suis preneur. merci.  [...] hahaha. revirement de situation. la séquence ne peut pas etre synthétisée à cause de longue portion de G/C qui rende la synthèse impossible...j'ai fait hier une PCR avec 5% de DMSO et une première étape de PCR a 94°C durant 3min puis en cycle (94°C 45 sec, un gradient pour la temperature du Tm de 50 à 70°C, et l'elongation)-.  [...]