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[Biologie Moléculaire] western blot/azide?

pendant l'étape de blocage de Western Blot on utilise le lait (écremé) pour éviter les bruit du fond mais aussi de l'azide à 0.01%.  [...] Pour ce dernier (azide ou azoture) je pense que c'est pour la conservation Et pourquoi on ne l'utilise pas pendant l'étape où on va ajouter le deuxième anticorps couplé à HRP.  [...]

[Biologie Moléculaire] Western blot

J'ai une question qui va sans doute paraître naïve mais tant pis alors la voilà. Dans un Western blot par exemple, il y a une étape après l'électrophorèse dite de blocage qui consiste à saturer (souvent avec de la caséine ou du BSA) les sites non spécifiques, ce que je comprends bien dans le principe.  [...] La membrane ne peut plus coller de protéines aux endroits où des protéines s'y sont déjà fixées. Il reste cependant une surface importante encore adhésive où l'anticorps, qui est une protéine, se fixera. Pour l'empêcher on incube donc la membrane en présence de protéines, ainsi elle ne pourra plus scotcher l'anticorps, ce sera en quelque sorte comme si du ruban adhésif avait été souillé par de la poussière.   [...]

[Biologie Cellulaire] Problème immunofluo

Pour exemple. les protéines nucléaires nécessitent une étape de perméabilisation plus agressive que les protéines cytoplasmiques.  [...] fixation à la PFA, je n'utilise pas de méthanol étant donné que ma protéine pourrait avoir un lien avec le cytosquelette et il me semble que la fixation méthanol n'est pas top pour le cytosquelette... j'ai testé avec ou sans permeabilisation avec du triton, blocage lait ou blocage serum ou pas de blocage.  [...]

[Biochimie] Extraction d'une protéine nucléaire pour WB

J'ai d'abord commencer à faire une extraction au SDS (plus cocktail d'inihibiteur), j'ai aussi essayé tampon d'extraction classique (Triton, Glycerol, NaCl, EDTA, anti protéases). Apres dosage et dilution dans lameli, j'ai fait un WB (migration sur gel 10% SDS.   [...] merci du conseil. J'ai déjà essayé de mettre au point le temps de transfert. En semi sec et avec l'appareil de transfert qu'on a (appareil bio-rad, petit gel, epaisseur du gel 1mm max) 1h de transfert fait passer les prot sur le papier wattmann. Mais peut être qu'a l'époque j'avais pas regardé si haut donc cela coute rien de remettre cela au clair.   [...]

[Biochimie] Devoir de biologie pour demain

Le blocage de n'importe quelle étape entraîne l'absence de pigment brun, et donc l'apparition du phénotype alternatif yeux rouges vifs [rv].  [...] il va falloir y mettre un peu plus de bonne volonté, car il n'est pas question qu'on te fasse ton travail. Alors donne nous tes resultats, car il est tres surprenant que tu puisses démontrer qu'il y a deux genes, et que tu ne saches pas démontrer s'ils sont liés.   [...]

[Biologie Cellulaire] PBS ou TBS

Dans le 1er cas nous avons bloquer les sites spécifiques avec dans du tampon TBS (plus lait bien sur) alors que pour l'immunocytochimie, il y avait toujours le lait mais la solution tampon était du PBS.  [...] autre petite question. est que vous savez pourquoi le tampon de blocage contenait du Triton (solvant dont je connais le role ) pour l'ICC et pas pour le western.  [...]

[Biochimie] Contrôle d'inhibition de la dégradation lysosomale

J'inhibe la dégradation par les lysosomes (avec plusieurs concentrations de leupeptine) et j'aimerai trouver un contrôle positif de mon blocage c'est à dire une protéine qui s'accumule sous leupeptine en western.  [...] Déjà je pense que les protéines cytoplasmiques ne fournissent pas le meilleur groupe de protéines dégradées par cette voie, étant je pense dégradées principalement via le protéasome. Sinon je t'aurais dis les protéines anti-apoptotiques, fortement traduites mais aussi fortement dégradées.   [...]

[Immunologie] Protocole ELISA

La détection des anticorps se fait par test ELISA. Le sang des poissons est récupéré par la veine caudale et mis à coaguler une nuit à 4°C. Le sérum est ensuite récupéré et dilué. Les antigènes proviennent des parasites. L'anticorps de détection est une immunoglobuline anti-loup obtenue en injectant des antigènes de loup dans un lapin.   [...] pour affiner votre protocole, pensez à réaliser une étape de blocage après la fixation de votre antigène au fond du puits.  [...]

[Biologie Moléculaire] Western blot sur des echantillons de foie murins - Page 2

Mon 2e problem. Jai strippé mes membranes après la 1ere revelation. Apres blocage de la membrane, jai incubé les ACs 1aire, 2aire etc. Mais à la revelation, plus rien. LES Memes ACs qui avaient marché à la premiere revelation ne donnent plus rien. J'ai un film vierge.  [...] Pour pAkt, il faut essayer différentes conditions de blocage, notamment BSA et lait, et aussi changer le milieu d'incubation de l'anticorps (lait ou BSA également).  [...]

[Biologie Cellulaire] Immunocytolocalisation - Anticorps primaire 3-4h ?

Je pensais tester une hybridation de l'Ac primaire durant 3-4h. Est-ce que cela vous inspire ou pensez-vous que c'est perdu d'avance.   [...] En tout cas, je vous confirme bien que cela fonctionne. Comme je n'avais pas encore lu les dernières réponses, j'ai fait 30 min de fixation, blocage au lait 10% pdt 1h, 3h d'anticorps primaire et 1h d'anticorps secondaire.  [...]