• Santé - Enzymes, Température, Tampon

[Biologie Moléculaire] Montrer une phosphorylation de protéine en WB

Je parcourais un peu les topiques et en voyant le tien je me suis demandé si la précision de l'électrophorèse permettait de détecter une forme phosphorylée d'une qui ne l'est pas, 100 Da par phosphate me semblait peu Ce serait pas plus simple de le faire au MALDI.   [...] Oui c'est ce qu'on m'a dit. Il faut maintenant que je trouve ces enzymes. Tu as une idée du protocole (temps d'incubation, tampon, température, etc.).  [...]

Extraction enzymes

j'ai fait une extraction des enzymes à l'aide de tampon Tris-maléate contenant Triton X100,mais je ne sais pas à quelle température je peux conserver mes extraits.  [...] Je te suggère de les conserver à -20°C. Généralement on conserve les enzymes très concentrées en solution, à -20°C.  [...]

[Biologie Moléculaire] les enzymes de restrictions ...

j'ai lu que c'est 2 enzymes possédent l'activité de restriction et modification au méme temps comment ça ce passe.  [...] Je n'ai pas vraiment compris ta question mais la différence entre ces enzymes est la température et le tampon dans lequel elles agissent. Après je ne sais pas trop si ça répond à ce que tu as demandé.  [...]

[Biologie Moléculaire] Ligation

Pour le clonage 1. oui j'ai testé over night, pendant 1h, 20 min (avec le tampon 2X ultra rapide soit disant)... pour la durée, j'ai tout testé. Les enzymes ne me paraissent pas trop rares, surtout XhoI avec laquelle j'ai déjà fait un clonage.  [...] Pour le clonage 2. SmaI oui je l'utilise à température ambiante (soit 25°C à peu près) et seulement après je rajoute l'autre enzyme à 37°C.  [...]

[Biologie Moléculaire] Protocole digestion

Ben disons que la restriction ca peut prendre la tête, les enzymes qui ne coupent pas, les enzymes qui ne sont pas compatibles, faire du séquentiel. La chiotte quoi.  [...] Un collègue l'a beaucoup utilisé et c'est pas trop mal,mais avec des enzymes classiques (genre EcoRI, BamHI, etc.). Sinon, pour les PCR c'est suffisant. Je ne sais pas s'il s'est aventuré à le faire pour le séquencage.  [...]

[Biologie Moléculaire] Enzymes de restriction sur plasmides- Digestion complète et incomplète

La digestion incomplète est une digestion qui n'est pas efficace sur l'ensemble des molécules du substrat. Exemple. la moitié des plasmides sont digérés, l'autre moitié est intécte. Elle se produit quand l'enzyme n'est pas bien dosée, qu'elle n'est pas très active, que la température ou le tampon ne sont pas bien ajustés,  [...] aussi je cherche a savoir comment trouver la taille du vecteur pSK (environ 2900 pb) abres la double digestion par ces deux mêmes enzymes.  [...]

[Biochimie] dosage enzyme pour quoi utiliser le bain-marie ?

Je pense que pour la préparation du tissu dans le tampon, on dit qu'il faut travailler dans la glace 4C°,c'est pour inactiver l'enzyme(par le froid) et éviter l'augmentation de la température du tissu lors du broyage et de ce fait éviter la dénaturation de l'enzyme, car une enzyme soumise a basse température est inactivé mais elle n'est pas dénaturée (et qui est donc de ce fait détruite comme dans le cas d'une haute température).  [...] je crois que c'est pour travailler à une température donné pour pouvoir comparer ses résultats avec les normes ou d'autres résultats d'autres laboratoire, les conditions standards donc.  [...]

[enzymologie] Activité enzymatique et flux

Tu peux essayer de réaliser une colonne enzymatique en incluant ton enzyme dans un résine et tester différents tampons, et entre chaque tampon il va falloir que tu laves avec un tampon de référence pour mesurer une activité de référence car certains tampons testés pourraient dénaturer ton enzyme.  [...] Pour cela on va chauffer l'enzyme en la mélangeant à une résine qui se liquéfie à une température de 40-42°, on applique le mélange dans une burette chaude et on fait goutter la burette dans le tampon initial de l'enzyme (Tris par exemple) à tempréature ambiante ou même plus froid.  [...]

[Biotechnologie] Temperature d'hybridation pour southern Blot

Je suis entrain de rechercher un gene d'interet par southern Blot. J'utilise comme tampon d'hybridation, le Easy Hyb de ROCHE. J'ai utilise 65 degre comme temperature d'hybridation et apres les differents lavages (utilisant 65 degre de temperature de lavage, quand il le faut pour rester dans la stringeance) de ma membrane jai obtenu de tres beaux signaux.  [...] Mais le hic, cest que on me dit que avec ce tampon d'hybridation, la temperature a utiliser est au maxi 50 degre. Alors du coup sais pas si mes signaux obtenus sont specifiques ou si ma sonde a pris un coup apres hybridation dans une temperature si elevee.  [...]

Biologie moléculaire - Stringence

Je ne comprends pas très bien la différence entre une hybridation spécifique et une hybridation non spécifique dans le cadre de la complémentarité des bases dans l'ADN. Pourriez-vous m'éclairer s'il vous plait.   [...] En augmentant la stringence du tampon ou alors en augmentant la température utilisée lors de l'hybridation, on va sélectionner les hybridations entre les séquences qui ont un fort pourcentage d'identité. En effet, ces dernières pourront réaliser des interactions hydrogènes plus fortes sur l'ensemble de l'hybridation et donc l'hybridation sera plus stable dans un tampon stringent ou à haute température.  [...]