• Santé - Enzymes, Restriction, Digestion

[Biologie Moléculaire] Enzymes de restriction sur plasmides- Digestion complète et incomplète

.. bref, pour tout un tas de raisons. Et comme on ne maitrise jamais parfaitement chacun de ces paramètres, on ne peut pas non plus prévoir si la réaction sera complète ou non. Surtout si plusieurs enzymes différentes sont utilisées pour chacun des sites. Après, si on fait un électrophorèse, on peut quantifier l'avancement de la digestion pour chacun des sites, car en général, les différents fragements n'ont pas la même taille.  [...] sachant que pCR-gai est un plasmide d'environ 5500 pb qui contient la séquence codante du gene GAI (1579 pb), et le nombre de sites de restriction de HindIII est 2 et EcoRI est 2 par molécule.  [...]

[Biologie Moléculaire] Carte de restriction électrophorèse

J'ai réalisée une digestion d'un plasmide bactérien inconnu afin de déterminer sa carte de restriction. Pour cela, je l'ai digéré avec des enzymes de restriction. BamHI et EcoRI. J'ai fait une digestion avec chacune des enzymes tampon E pour BamHI et tampon MC pour EcoRI et une avec les 2 dans le tampon MC (activité 75% pour bamhI et 100 pour ecorI).  [...] En supposant que dans la double digestion mes 2 enzymes aient coupé au même endroit, je pense pouvoir multiplier 3090 par 2 soit 6180 pb pour la double digestion ce qui serait cohérent avec les autres résultats. Mais je ne comprends toujours par le résultat de cette double digestion, car selon moi j'aurais du obtenir les mêmes résultats que la digestion EcoRI sinon je ne peux pas trouver la carte de restriction de mon plasmide.  [...]

[Biologie Moléculaire] pcr sur colonies clonage

Si tu doutes vraiment de la PCR colonies dans tes conditions/enzymes/clonage, tu peux toujours tester sur quelques minipreps, mais je n'ai jamais eu le cas.  [...] J'ai utilisé la kit Qiagen avec succès pour extraire mon produit de PCR du gel d'électrophorèse. En revanche, je ne connais pas les autres kits. Je n'ai pas fait de clonage depuis maintenant deux à 3 ans, mais dans mon souvenir, je ne faisais pas de purification après la digestion, mais la ligation directement.  [...]

[Biologie Moléculaire] Protocole digestion

Ben disons que la restriction ca peut prendre la tête, les enzymes qui ne coupent pas, les enzymes qui ne sont pas compatibles, faire du séquentiel. La chiotte quoi.  [...] derniere chose, n'oublie pas qu'il ne faut pas depasser 10% de ton volume total en enzyme de restriction. Sinon le glycerol qu'elles contiennent fini par totalement perturbé ta digestion (inhibition, activité star etc...).  [...]

Purification Séphacryl S-400

Sephacryl S-400 High Resolution to separate polysaccharides, macromolecules with extended structures and even small particles such as plasmids. (fractionation range globular proteins 2 × 104–8 × 106).   [...] J'aurais voulu savoir si le séphacryl S-400 permettait d'éliminer efficacement la Taq pol, car actuellement je voudrais faire du clonage par restriction/ligation. Je sais que la taq pol peut être gênante après digestion des fragments PCR par des enzymes de restriction, puisque les résidus de Taq pol viendraient potentiellement compléter les extrémités collantes.  [...]

[Biologie Moléculaire] TP digestion ADN par enzymes de restriction par électrophorèse sur gel d'agarose

Pour t'amener sur la bonne réflexion. sais-tu si l'ADN de ce virus est linéaire ou circulaire As-tu la carte du génome qui te montrerait les sites de restriction dudit génome.  [...] Tu as l'air de savoir ce qu'est une enzyme de restriction et aussi de savoir interpréter une électrophorèse, je ne vois pas bien ce qui te bloque pour réussir ton exercice.  [...]

électrophorèse sur gel d'agarose

J'ai eu un TP de biotechnologie où on a fait une électrophorèse sur gel d'un plasmide purifié non digéré et d'un plasmide purifié dirigé par deux enzymes de restriction.  [...] J'ai eu les résultats de la digestion et j'observe dans chaque cas 2 bandes. pour le plasmide non digéré j'ai une bande claire puis une bande foncée. et pour le plasmide digéré, j'ai d'abord la bande foncée puis la bande claire.  [...]

[Biochimie] Preparation et analyse de plasmides

Sinon, la digestion c'est quand tu mets ton enzyme dans le mélange réactionnel et que tu attends un pitit moment pour qu'elle agisse (faut-il qu'elle parcoure la chaîne de caractères et trouver la regexp qui match quoi). Il faut donc que d'une façon ou d'une autre, on teste le succès de la chose.  [...] donc, avant digestion, on regarde la tête de l'ADN *non digéré* sur gel. Après digestion, on compare. si notre ADN a la même tête, c'est FAIL. si on a des bandes qui correspondent à ce qu'on a calculé d'après les positions des sites de restrictions (les regexp), c'est PASS.  [...]

Différences d'ADN entre les ètres vivant ?

Je suppose que si l'on fait intervenir une série d'enzyme de restrictions et qu'on fait une électrophorèse, on pourrait voir se détacher des gênes inattendus (chez l'homme) d'autant plus facilement que l'espèce est éloignée. Mais n'ayant jamais pratiqué ce genre d'analyse (et je l'ai vu faire en laboratoire qu'une seule fois) j'ignore si ce serait frappant ou pas (ou pour reprendre la métaphore d'Elianix, j'ignore si on peut se rapprocher facilement plus près pour mieux voir ).  [...] Oui, bien sûr, il doit exister des enzymes de restriction très spécifiques à l'homme (je ne suis pas sûr que ce soit suffisant. Distingueraient-ils des grands singes par exemple Plus d'info si un biologiste passe par là).  [...]

plasmide -digestion par enzymes de restriction

Tu digères un plasmide lorsque tu veux modifier ce dernier, y rajouter un fragment ou en retirer un. On passe avant tout par cette étape de digestion. Après tu as un étape de ligation si éventuellement tu veux recirculariser le plasmide après y avoir insérer un fragment entre XhoI et NcoI.  [...] Effectivement, le nombre de N équivaut à ce qu'il y a de part et d'autres des sites de restriction. Tu peux donc déterminer le nombre si tu connais la taille du plasmide. Mais possèdes-tu ces informations.  [...]