• Santé - Enzymes, Restriction, Construction, Vecteur

[Biotechnologie] Vecteur d'expression et enzymes de restriction

Je ne suis pas certaine d'avoir bien compris le recours aux enzymes de restriction dans la construction d'un vecteur.  [...] On commence par insérer le promoteur qu'on lie au vecteur grâce à une ligase (en supposant bien sûr que les deux extrémités soient compatibles), puis on insère le gène qu'on lie au promoteur et enfin on fait de même avec le terminateur.  [...]

[Biologie Moléculaire] Protocole pour une ligature + tranformation ?

Voilà, je continue gaiement mon stage à Barcelone, mais maintenant j'ai un petit souci. je dois faire une construction plasmidique toute simple, donc digestion de l'insert et du vecteur par 2 enzymes de restriction, ligature, et puis transformation de bactéries E. coli.  [...] Première question à se poser. Tes enzymes sont elles compatibles entre elles Si tu les as du même fournisseur (le plus simple quand même) tu peux aller voir leur charte d'enzyme de restriction en générale disponible sur internet. Choisi bien ton buffer.  [...]

[Biologie Moléculaire] Projet de clonage

dans le principe c'est bon, mais ensuite il faut que tu connaisses les cartes de restriction des vecteurs pour voir le sites disponibles et déterminer si tu peux faire un clonage orienté et cohésif de ton gene. Il faut aussi que tu sois plus précis, par exemple pour les bactéries, il faut que tu sois capable de déterminer si les bactéries ont intégré la construction, tu vois de quoi je parle.  [...] - Enfin on te demande de vérifier ta construction PCDNA3-GFP une fois que tu l'auras obtenue, c'est-à-dire que tu dois trouver une ou plusieurs enzymes de restriction qui te donneront un résultat différent en fonction de si tu as ton insert ou non. Par ex le choix d'une enzyme pour laquelle tu as 1 site dans ton vecteur PCDNA et un site supplémentaire dans ton insert est idéal car tu auras 1 bande = ton vecteur linéarisé si ton vecteur ne contient pas l'insert, et 2 bandes avec des poids moléculaires bien précis si tu as bien ton insert.  [...]

[Biologie Moléculaire] Carte de restriction du plasmide pAK400

Je trouve toujours incroyable d'avoir un plasmide sans carte. Surtout si il ne s'agit pas d'un plasmide commercial où la référence n'est facilement trouvable. Encore récemment j'en ai reçu un sans carte... J'ai reconstitué ce que j'imaginais être le plasmide à partir des publis de mes donateurs, mais évidemment les profils de restrictions ne correspondaient pas à ce que je devais obtenir.  [...] Le plasmide, nous l'avons retrouvé en mettant de l'ordre dans nos congélateurs et il tient absolument à l'utiliser pour cette construction.  [...]

in-fusion cloning

J'aimerai savoir si l'un de vous avez déjà tenté de faire un clonage en utilisant un in-fusion cloning kit sans linéariser le vecteur cible.  [...] j'ai la séquence de mon épisome mais je n'arrive pas à le couper avec des enzymes de restriction qui sont sensées le couper. C'est pour cela que j'aimerai savoir si il en linéarisant ma construction et en utilisant la recombinase il y a des chances que j'obtienne la fusion des deux.  [...]

[Biochimie] Vecteur d'expression pour une proteine recombinante

-soit ton vecteur est linéarisé avec 2 enzymes produisant des extremités différentes et non compatibles, les mêmes extrêmités que tu retrouves sur ton insert, et dans ce cas la construction ne peut redevenir circulaire qu'en incorporant l'insert.  [...] Le rapport nombre de colonies dans la boite témoin/nb de colonies sur la boite insert_vecteur donne une bonne indication de la réussite de la ligation et de l'incorporation de ta construction dans le vecteur. Il y a en général quand même des colonies dans la boite controle, prinicpalement parce que il subsiste quelques exemplaires circulaires de ton vecteur.  [...]

[Biologie Moléculaire] Beta galactosidase chez Saccharomyces cerevisiae

Autre question à l'épreuve des balles. t'es certain que ton gene beta gal est bien intégré et qu'il est en phase Pas une petite délétion due aux enzymes de restriction durant le clonage La même question vaut d'ailleurs pour ta construction. Ton récepteur est bien synthétisé, y a pas de souci de phase.  [...] Là même chose, j'ai réalisé ma construction de telle sorte à ce que mes fragments peptide promoteur, peptide signal et beta gal soient en phase, j'utilise pour celà des sites de restriction bien sûr, mais j'ai vérifier avant de faire mon clonage.  [...]

[Biologie Moléculaire] utilisation de serial cloner

Alors j'explique mon problème, je dois faire un clonage avec des sticky ends et quand j'essaye de faire une construction avec serial cloner je n'arrive pas à sélectionner une enzyme pour qu'il coupe lui même au niveau du site de restriction. Est-ce tout simplement possible Si non comment faites vous.  [...] J'ai aussi une autre question, toujours sur Serial Cloner, est-il possible de couper par une enzyme de restriction et avoir la séquence correspondante à l'ADN linéaire après la coupure.  [...]

[biologie moléculaire] Probleme expression apres transfection stable

J'ai réalisé une construction en vue de l'expression d'une protéine en stable par des cellules HeLa. Le vecteur utilisé est le pIREShyg3, qui comme son nom l'indique contient.  [...] La construction a bien marché, le séquençage est OK, les cellules transfectées résistent à l'hygromycine (pas les cellules non transfectées contrôle), mais pas de trace de notre protéine, rien. alors que l'expression est importante avec un vecteur pCMV en transitoire.  [...]

Construction d'un vecteur

Salut à tous svp qui peut m'expliquer le principe de la construction d'un vecteur.  [...] Je ne comprends pas bien ta question. Tu voudrais savoir comment un vecteur se construit ou bien à quoi sert un vecteur en biologie moléculaire.  [...]