• Santé - Enzyme, Restriction, Vecteur, Produit, Digestion

Confirmation de l'insertion d'un gène dans un plasmide

Je travaille actuellement sur un clone et je veux savoir s'il est possible de confirmer une ligation entre un gène et un vecteur plasmidique et par quelle méthode puis¬je la faire.  [...] Oui c'est toujours comme cela que l'on fait d'ailleurs. On établit la carte de restriction du plasmide en utilisant des enzymes de restriction. A minima, une enzyme de restriction qui ne coupe qu'une fois permettra de linéariser le vecteur et d'en trouver la taille en faisant migrer le produit de digestion dans un gel d'agarose.  [...]

[Biologie Moléculaire] pcr sur colonies clonage

Quand je clone, je crible mes clones sur colonies et je ne séquence que 2 ou 3 clones qui sont positifs en PCR. D'ailleurs j'utilise toujours une amorce dans l'insert, l'autre dans le vecteur pour être sûr de la nature de mon vecteur, de mon insert, de la taille de mon insert et de sa position dans le vecteur.  [...] J'ai utilisé la kit Qiagen avec succès pour extraire mon produit de PCR du gel d'électrophorèse. En revanche, je ne connais pas les autres kits. Je n'ai pas fait de clonage depuis maintenant deux à 3 ans, mais dans mon souvenir, je ne faisais pas de purification après la digestion, mais la ligation directement.  [...]

[Biologie Moléculaire] Construction d'une banque d'ADNc

contrôle-qualité de l'ADN recombinant. transformation dans E. coli, sélection des clones recombinants et extraction du vecteur d'expression.  [...] Une banque d'ADNc correspond aux clonages de tous les ADNc obtenus dans un vecteur. Cette banque est alors utilisée dans un crible afin d'identifier le clone possédant le(s) gene(s) recherché(s). Une fois les clones identifiés, il s'agit de preparer les plasmides et de les sequencer afin de caracteriser le fragment cloné.  [...]

[Biochimie] Clonage après purification sur gel

L'amplification par PCR va donner des amplicons non méthylés (et aussi ne contenant plus ta cassette vu que l'amplification du vecteur exclura la cassette). Tu ajoutes à ton produit de PCR l'enzyme DpnI qui va cliver l'ADN méthylé en fragments de quelques centaines de bases (enzyme de restriction reconnaissant un site de 4 bases méthylé).  [...] Ainsi, seul ton vecteur d'origine (celui contenant ta cassette) sera digéré par cette enzyme, et pas ton produit de PCR, ce qui te permet de bien te débarrasser de ta cassette.Cela pourrait être une stratégie de rechange par rapport à ta stratégie actuelle qui est de simplement extraire la cassette avec des enzymes de restriction correspondant à ton futur site d'insertion.  [...]

[Biologie Moléculaire] Probleme de clonage avec pT7Blue

On obtient un gel avec des produits de PCR de colonies bleues et blanches, de plasmides digérés par enzymes de restriction et des plasmides non digérés provenant de colonies bleues et blanches. (= 6 bandes)+marqueur de taille.  [...] une étape de digestion (ouverture) de ton vecteur plasmidique (là où tu as inséré ton produit de PCR) par diverses enzymes de restriction.  [...]

[Biologie Moléculaire] Contrôle négatif clonage

Dans tes colonies vecteur+insert il y en aura forcément sans insert (à verifier par PCR ) Si ton vecteur a été digéré par 2 enzymes de restriction différentes, il ne pourra pas se refermer, même avec ligase. Donc dans ce cas précis il ne devrait pas y avoir de colonies sur ton contrôle.  [...] Tu as donc fait une simple digestion de ton vecteur (une seule enzyme de restriction) =. il peut donc se recirculariser tout seul ou avec ligase (voilà qui répond au post de Wobinet).  [...]

Enzyme de restriction et activité étoile!

L'activité étoile survient lorsqu'une digestion ne se produit pas dans les conditions optimales de l'enzyme. L'enzyme se met à couper a peu près partout et son site de restriction, souvent, se raccourci et l'enzyme produit plus de fragments que supposé. Ma question est, disons qu'une enzyme produit des extrémités 5' cohésives théoriquement, est-ce qu'elle va continuer de produire des extrémités 5' cohésives même si elle est dans des conditions d'activité étoile.  [...] Sinon, si l'objectif est de n'obtenir que des fragments à bouts cohésifs, c'est une autre paire de manche (pourquoi ne pas essayer une digestion partielle). Ou un clonage qui permettent d'insérer un site de restriction plus commun.  [...]

test de paternité

Amplification du locus par PCR (à priori par l'enzyme taq polymérase,les amorces étant le plus important pour cibler la séquence intéressante).  [...] Digestion du produit par l'enzyme de restriction (qui varie suivant la squence qui nous intéresse).  [...]

[Biologie Moléculaire] précipitation de l'ADN diminution de la taille de mon fragment!!!

je digère un vecteur d'environ 6000pb avec une enzyme de restriction qui coupe une seule fois dans ce vecteur. je vérifie ma digestion sur gel d'agarose...une belle bande à 6000pb. je décide de précipiter (avec de l'éthanol) l'ADN sur la nuit. le lendemain, je re-dépose sur gel.  [...] Serait-il possible que ton endonucléase de restriction ait une activité qui puisse être modifiée en présence de fortes teneurs en éthanol (admettons une gène sur le site de reconnaissance) entraînant un mésappariement et la catalyse d'une coupure non spécifique.  [...]