• Santé - Enzyme, Contrôle, Plasmide, Transformation

[Biologie Moléculaire] Problème de construction d'une banque d'ADNc

Est-ce que vous rajoutez bien la BSA qui est nécessaire pour un clivage optimal par Sfi1 Quel contrôles intra-manip avec vous fait (contrôle de clivage par l'enzyme, de recircularisation du vecteur,...) Quelles bactéries utilisez-vous pour la transformation Avez-vous fait le contrôle de base nécessaire sur la transformation des bactéries. transformation avec un plasmide contrôle.  [...] Puis transformation de 20 µl de bactéries chimiocompétentes avec 8 µl de produit de ligation. Ca marche très bien mais tes conditions semblent assez proches, tu dis qu'une autre ligase a donné les premiers résultats donc c'est sur la bonne voie.  [...]

[Biologie Moléculaire] Mutagénèse dirigée

Dans ce kit le contrôle positif de la mutagénèse utilise un plasmide Whitescript de 4,5 kb. Après la mutagénèse et la digestion des produits par l'enzyme Dpn1, je fait un gel de 0,8% agarose pour vérifier avant la transformation si ma mutagénèse à marché.  [...] ...Seulement là j'ai un petit soucis parce que dans mon contrôle (plasmide whitescript) et dans mon echantillon, tout ce que je dépose sur mon gel reste dans le puit...(je dépose 5µl de produit de PCR).  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème de ligation??

es-tu sûr que ta transformation s'est bien faite Qu'as-tu utilisé comme contrôle (contrôle d'activité de la ligase, contrôle de clivage effectif par les deux enzymes, contrôle de transformation).  [...] J'ai d'une part fait une ligation avec mon plasmide(digéré), l'enzyme et sans mon insert et d'autre part le plamide,l'insert et l'enzyme je n'ai donc pas de contrôle plasmide liguer par contre je ne pense pas que se soit forcement la transformation vu que d'habitude je n'ai pas de problemes mais j'ai tout de même un petit doute sur la ligation avec la TAKARA qui préconise 5min à 25°C ou 30min à 16°C j'ai donc essayé les deux methodes et j'ai même prolongé à 2h30 à 16°C donc est ce que quelqu'un a déjà eu un soucis avec cette enzymz car les temps de ligation me semblent courts...sinon je ne vois pas.  [...]

clonage qui ne fonctionne pas ? ratio ?

Pour ma ligation j'ai aussi utilisé un controle plasmide sans insert + ligase mais aucune pousse bacterienne apres transformation.  [...] Ce n'est pas mon cas car mon controle de transformation est justement le plasmide contenant l'insert (fournit par le collaborareur qui est celui qui a été digéré et purifié sur gel) et les bacteries pousse.  [...]

[Journal club] Immortalisation et Transformation d'une cellule humaine à partir d'éléments génétiques définis.

Le contrôle avec le rétrovirus seul aurait permis de contrôler que le processus de transduction rétrovirale n'est pas lui-même responsable de la transformation et/ou de l'immortalisation des cellules saines.  [...] A priori si on séléctionne uniquement l'intégration et que l'on construit la lignée sur les cellules séléctionnées il y aura plusieurs sites d'intégration. La lignée est hétérogène. Si l'on fait une transformation controle avec un plasmide vide ou contenant un élément neutre, on devrait pouvoir discriminer les effets inserts dépendants des effets vecteur dépendants.  [...]

[biologie moléculaire] opéron lactose

je demande essentielement lorsque par exemple je place une bactérie dont le genome n'est pas affécte par des mutations dans un milieu de culture qui ne contient pas des sources de nutrition (ne contient ni lactose ni la resultat de la catabolisme de ce dernier signifie du glucose et du galactose ),dans ce cas l'operateur est occupé par le represseure et par la suite pas de transcription,et d'aprés mes connaissance je sait que le gene lacA donne une protéine qui transforme des autres types des molécules en des analogues du lactose(par exemple le cholesterol)lors de l'epouisement de la cellule,mais comment se fait ce ci si l'operateure est bloqué par le represseure.  [...] transformation de bactéries lac- avec un plasmide codant pour le promoteur de l'operon lactose couplé au gène lacz ou CAT et vous regardez le niveau d'expression basal du gène par spéctrométrie après révélation de la présence de l'enzyme que vous aurez choisi (pour le lacz j'utilise le x-gal, pour CAT j'utilise plutôt un test elisa).  [...]

[Biologie Moléculaire] Contrôle négatif clonage

- l'efficacité de transformation obtenue avec le produit de ligation. nombre de colonies / µg d'ADN de plasmide digéré incubé avec insert et ligase.  [...] Par contre, je suis d'accord avec le fait que mettre l'insert n'est pas absolument nécessaire. Un contrôle plasmide digéré + ligase en ayant fait un gel rapide pour vérifier que la digestion est totale est suffisant pour vérifier l'activité ligase. Dans ce cadre, la déphosphorylation ajoute une inconnue énorme puisqu'avec ce contrôle on ne peut pas faire le différentiel entre un plasmide mal déphosphorylé, un plasmide trop déphosphorylé où les extrémités ont commencé à être dégradées par CIP et qui n'est pas ligable, et une activité ligase faible.  [...]

[Biologie Moléculaire] Expression de protéines grâce au pGEX. DH5alpha ou BL21?

J'ai transformé des bactéries DH5alpha avec mon plasmide GST et mon plasmide GST-prot d'intérêt. Pour chaque transformation j'ai effectué un contrôle non induit. J'ai testé deux stragégies d'induction avec 1 mM IPTG. 2h à 37°C ou toute la nuit à 30°C.  [...] De la même manière j'ai co-migré un extrait protéique obtenu après transformation des bactéries avec un pGEX vide et là aussi la colonne reste entièrement vide. Ces contrôles signifient bien que mon anticorps ne marque pas une protéine bactérienne endogène ou un bidule provoqué par l'insertion du seul plasmide.  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème lors de la transformation avec DH5a E.coli.

1 contrôle de transformation, avec une dizaine de picogrammes de pUC18 ou équivalent pour des bactos électrocompétentes qui sont attendues à une efficacité de 10^8 colonies par ug de plasmide.  [...] Normalement dans le kit tu devrais avoir un plasmide controle a transformer. Il faut vraiment que tu verifies tes cellules, ca arrive tres souvent.  [...]

[Biologie Moléculaire] clonage petit fragment d'ADN

Fais tu une transformation contrôle avec l'insert seul déphosphoré + ligase Y a-t-il autant de colonies que dans plasmide + insert.  [...] Je n'ai pas fait de transformation contrôle avec l'insert seul déphosphorylé+ligase. Flyingbike peux-tu me dire l'utilité de ce contrôle car si je transforme mes bactéries avec ce contrôle, je n'aurai aucun transformant.  [...]