• Santé - Enzyme, Activité, Star

[Biologie Moléculaire] Protocole digestion

derniere chose, n'oublie pas qu'il ne faut pas depasser 10% de ton volume total en enzyme de restriction. Sinon le glycerol qu'elles contiennent fini par totalement perturbé ta digestion (inhibition, activité star etc...).  [...] Le top pour la digestion (selon protocole promega/ NE Biolabs, teste et approuve par tout le labo) C'est 50 uL volume final (ADN purifie, pas tout juste sorti de PCR), et max 2 uL d'enzyme. Un volume plus petit ca coupe mal, et plus d'enzyme au mieux ca change rien, au pire ca coupe mal ou avec activite star.  [...]

plamide repris en EDTA et digetion enzymatique

De quelle enzyme s'agit t'il Certaines présentent une activité STAR qui correspond à une reconnaissance anormale de sites liée à une perte de sélectivité. Pour l'éviter il faut éviter de travailler avec un excès de sel ou une durée d'incubation trop longue mais d'autres paramètres ont une influence, peut-être que la concentration en EDTA peut jouer.  [...] J'ai fait un test. j'ai refait une digestion avec le plasmide repris en EDTA mais je n'ai pas mis d'enzyme. Résultat. mon ADN est dégradé par le tampon, je l'ai fait avec les kits de deux fournisseurs. Il ne s'agit donc pas d'activité STAR, car il n'y pas d'enzyme.  [...]

enzymes de restriction

d'accord merci. http.//biologie.univ-mrs.fr/upload/p...diantfinal.pdf (page 2 le mode d'action des enzymes de restriction) les enzymes générant des bouts collants vont a chaque fois couper après un G ou ça dépend et ceci est seulement un exemple qu'est ce qui confère a l'enzyme sa faculté a généré soit des bouts collant 5' soit 3'.  [...] On parle alors d'activité star qui altère la fidélité de l'enzyme. Les conditions expérimentales de rapport enzyme.substrat, volume de digestion, temps de digestion, force ionique et pH des tampons de digestion, présence ± concentrée de glycérol ont toutes un fort impact sur la fidélité de l'enzyme à couper la séquence d'ADN à l'endroit désiré et pas n'importe où ailleurs.  [...]

[Biologie Moléculaire] enzyme de restriction

Tu as peut-être utilisé l'enzyme dans des conditions imparfaites (erreurs de proportions, de temps ou de durées d'incubation). Pour certaines enzymes au moins, cela entraîne des problèmes de spécificité si bien que l'enzyme reconnait et clive d'autres sites. On parle d'activité STAR.  [...] Cet effet Star n'est pas connu pour l'enzyme Mnl1, mais j'ai constaté que le fournisseur avait récemment changé de tampon de réaction pour cette enzyme, et moi j'ai utilisé l'ancien, ça a peut-être un lien...en tout cas, merci de vos réponses.  [...]

[Biologie Moléculaire] pourquoi parle-t'on d'effet "star"

On nomme l'effet star le pourcentage de coupures non canoniques (erronées) réalisées par une enzyme de restriction (EcoR1, dont la séquence canonique est AATT) augmente linéairement avec la pression osmotique. Ceci est interprèté comme la nécessité de l'expulsion de l'eau interfaciale du domaine de liaison enzyme-ADN.  [...] Aux fortes pressions hydrostatiques l'eau interfaciale est stabilisée, la reconnaissance ne peut se faire et toute activité de coupure enzymatique est bloquée. On peut extraire une partie de l'eau d'hydratation en augmentant la pression osmotique, dans ce cas on favorise la reconnaissance et la liaison enzyme-ADN et donc la coupure de celui-ci, même pour des sites non canoniques.  [...]

[Divers] difficulté à lire graphe

Je dirais que StAR est l'enzyme des rats témoins, puisqu'il est rare qu'une mutation, surtout pour StAR, confère un avantage enzymatique.  [...] Tout est dans le pourcentage des ordonnées. Tu n'as pas les valeurs absolues de tes quantités de protéines produites, mais seulement le rapport Qtité(mutant)/Qtité( normale ) exprimé en pourcentage.   [...]

[Biologie Moléculaire] Carte de restriction électrophorèse

J'ai réalisée une digestion d'un plasmide bactérien inconnu afin de déterminer sa carte de restriction. Pour cela, je l'ai digéré avec des enzymes de restriction. BamHI et EcoRI. J'ai fait une digestion avec chacune des enzymes tampon E pour BamHI et tampon MC pour EcoRI et une avec les 2 dans le tampon MC (activité 75% pour bamhI et 100 pour ecorI).  [...] Sinon cela peut-être du à l'activité star de bamHI qui est capable de reconnaitre les sites de EcoRI mais dans ce cas là, on en revient toujours au même, pour la double digestion, j'aurais dut obtenir les mêmes fragments que pour ceux de ecoRI.  [...]

[Biologie Moléculaire] précipitation de l'ADN diminution de la taille de mon fragment!!!

Serait-il possible que ton endonucléase de restriction ait une activité qui puisse être modifiée en présence de fortes teneurs en éthanol (admettons une gène sur le site de reconnaissance) entraînant un mésappariement et la catalyse d'une coupure non spécifique.  [...] Je sais que sur un ADN séché à l'éthanol une activité protéique puisse sembler improbable, mais sait-on jamais, de l'eau résiduelle pourrait rester.  [...]

Génome mitochondrial

Bien sur le repertoire de réactivités chimiques des chaînes latérales d'acides aminés étant limité, certaines enzymes contiennent des éléments non protéiques en sus des chaînes d'acides aminés. groupements hèmes, sulfides, pyridoxal, ions métalliques coordinés.  [...] Il faut également préciser que certaines activités enzymatiques sont le fait d'ARN et non de protéines. spliceosome du noyau, grosse sous unité du ribosome. Mais ça reste très minoritaire (quoique situé à des fonctions clés).  [...]

[Biologie Moléculaire] Ligation

Ensuite qu'elles sont les conditions de tes digestions Car BamHI et NotI ont une star activity qui peut être induite par une digestion trop longue ou alors par une concentration en glycerol trop importante dans ton mix réactionnel.  [...] Comme a dis Franckeeuuhh, as tu bien vérifié la quantité de glycérol dans ton mix réactionnel C'est vraiment critique pour certaine enzyme, dont NotI (moins pour BamHI, qui est plus costaude). En général, on dit qu'il faut un µl d'enzyme pour 10µl de volume total réactionnel (dans le cas où tes enzymes sont resuspendu dans 50% de glycérol). A toi de calculer.  [...]