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[Biologie Moléculaire] Vecteur pET15b et 19b

Je suis entrain de tenter de sur-exprimer des protéines chez les cellules BL21 DE3 et malheuresement ça ne surexprime pas... Le vecteur utilisé est le pET19b et en parcourant un peu la biblio je suis tombé sur un article où pour la surexpression de la même protéine le vecteur pET 15b a été utilisé.  [...] C'est possible mais ce qui me semble plus probable, c'est que tu as de la protéolyse spontanée entre le tag et ta protéine d'intérêt dans un seul des deux cas. Ta protéine est présente dans le lysat cellulaire ou non.  [...]

ubiquitine et protéasome

Je t explique la manip. Enfait je suis entrain de créer le vecteur de clonage permettant de surexprimer la protéine permettant de capter une autre pour l'envoyer au protéasome. Est ce que tes inhibiteurs peuvent s utiliser sur des cellules S2+ Est ce que tu penses que si je transfecte ce vecteur dans ces cellules en presence d'inhibiteur et que je marque ma prot soit disant dégradée je pourrais par cette methode confirmer ou pas sa dégradation.  [...] Je t explique la manip. Enfait je suis entrain de créer le vecteur de clonage permettant de surexprimer la protéine permettant de capter une autre pour l'envoyer au protéasome. Est ce que tes inhibiteurs peuvent s utiliser sur des cellules S2+.  [...]

biologie cellulaire

* le réticulum endoplasmique(RE) constitue le site du production des proteines et des lipides transmembranaires.en effet le RE cpture certaine proteines de cytosol qui sont entrain d'etre synthétiser, il s'agite des proteines transmembranaires.  [...] ce qui à été synthétisé (protéine et lipides) est ensuite envoyé via des saccules vers l'appareil de Golgi qui va ensuite rediriger les protéines et lipides là ou la cellule en aura besoin (vers les membranes pour ton cas puisque tu parles de lipides et protéines membranaires).  [...]

culture cellulaire de cellules souches

je suis actuellement entrain d'essayer de faire pousser des cellules souches neuronales (dans le cadre d'un projet scientifique de master sur les maladies neurodégénératives)... Cependant, au bout du deuxième jour de culture, mes cellules s'arrondissent et finissent par mourrir.  [...] ce sont des cellules souches embryonnaires neuronales. Je pense avoir trouvé le problème. la fibronectine utilisée pour coater les boites.  [...]

[Biologie Moléculaire] Technique Laurière et Western Blot

Je suis actuellement entrain de tester la technique de Laurière en Western Blot, pour transférer des protéines d'un gel de polyacrylamide sur une membrane de nitrocellulose.  [...] Ce problème n'en est certainement pas un. vous augmentez l'ampérage pour transférer les grosses protéines donc les petites protéines ont suffisamment de temps pour traverser la membrane. Il n'y a rien d'illogique.  [...]

observation métaphase

afin de pouvoir observer une metaphase, qui ne dure que quelques minutes, mieux vaut au prealable traiter les cellules avec de la colchicine, qui inhibe la formation des microtubulis,. de cette mainere les cellues ne peuvent pas passer dans la telophase et l observation est possible. voila.  [...] D'abord des BASES. nos cellules contiennent toujours les 46 chromosomes ( 23 paires ) qui t'interessent. Mais quand les cellules ne sont pas entrain de se diviser la matière de ces chromosomes ( l'ADN ) est en vrac, en flaques désorganisées OK.  [...]

[Microbiologie] purification des protéines recombinantes

[Microbiologie] purification des protéines recombinantes.  [...] je suis entrain de lire le protocol qui me permet de purifier les protéines recombinantes en utilisant le kit GST BULK KIT avez vous un schéma ou une séquence qui montre la démarche expérimentale utilisée pour purifier les protéines en utilisant la colonne Glutathione Sepharose 4B c'est plus explicite qu'un texte.  [...]

[Biologie Cellulaire] PFA fixation

Encore une fois j'ai besoin de votre aide...Je voudrais savoir ce que fait la PFA dans les cellules pour la fixation. En fait, je suis entrain de tester l'éfficacité de transduction de l'AAV8-GFP dans mes cellules en régardant l'expression de la GFP à 24h et 72h.  [...] . La PFA fixe les protéines de tes cellules en creant des liaisons covalentes... c'est assez solide et même si tu a mis tes cellules a 37 plutôt qu'a 4 la dénaturation doit être assez limité... Je te conseille d'essayer tu vas vite savoir après tes immuno si t'arrive a marquer quelque chose mais je pense qu'il n'y aura aucun problèmes (perso j'ai laisser des plaque a 4 °c pendant 6 mois et fait mes marquages après c'etait niquel...).  [...]

western-blot

je suis entrain de faire des western sur des mutants afin de voir la différence d expression d une protéine dans ces lignees. Or je suis obligé pour cela de précipiter mes protéines sinon je n ai pas les quantites suffisantes.  [...] tu peux couper ton gel en deux. Une partie de ton gel va être colorée au bleu de Coomassie et l'autre partie va être transférée sur membrane. tu peux grâce à la coloration au bleu déterminer si tu as déposé une quantité équivalente de protéines sur gel.  [...]

Synthèse des protéines ?

Bonjour je suis entrain de réviser mon cour de bio sur la synthèse des protéines et je viens de me rendre conte qu'il y a un trucs sur lequel je bloque, j'ai regardé sur plusieurs bouquins de bio mais ça ma enbrouillé.  [...] Je vient de comprendre. OUI ce que tu as dis était bon dsl. C'est a cause de mon cour j'ai marqué une bétise ou le prof a du ce tromper je lui demanderai en tout cas merci beaucoup. cordialement.   [...]