• Santé - Efficacité, Transfert, Membrane

Un problème de northern blot !

Les chercheurs de la publication réalisent un northern blot pour mettre en évidence la présence d'ARNm patB (hybridé avec une sonde), mais réalisent dans un second temps un northern blot témoin à l'aide d'ARNr 23S. Les données concernant l'ARNm patB sont ensuite dits normalisés par l'ARNr 23S et livrés sous forme de graphique.   [...] Les ARNr etant exprimes de facon quasi constantes dans les cellules. donc normaliser les resultats par rapport aux ARNr permet de t'assurer que si tu vois des variations d'intensites dans ton northern avec ton gene d'interet, cela ne proviens pas d'efficacite d'extraction differentes, d'efficacite de transfert sur la membrane differente, d'une degradation des ARN dans tone chantillon par une contamination par une RNAse etc.  [...]

[Biologie Moléculaire] Vérification transfert W.Blot

En fait quand on fait un western, on part du principe que pour des proteines de taille standard, si elle ne sont plus dans le gel apres transfert et coloration au bleu de coomassie, alors elles sont sur la membrane. Ceci est vrai si la polarité a été respectée durant le transfert, sinon les protéines sont dans le tampon et pas sur la membrane (mais dans ce cas, ce sont toutes les protéines).  [...] Un autre test a faire est de colorer la membrane apres transfert au rouge ponceau (coloration transitoire qui disparait apres lavage dans de l'eau ou du PBS). Ceci te permet de vérifier que des protéines ont bien été transférées sur la membrane, de manière homogène, et qu'il n'y avait pas de bulles d'air.  [...]

[Biologie Moléculaire] Western Blot Transfert sur membrane

Je dois faire des western blot sur proteine petit PM (20kDA), mais avant mon maitre de stage veut que j'optimise les conditions donc je fais juste des western avec la beta actine, et le transfert sur membrane ne marche jamais. J'ai essayé 1h 100V (je mets 3 membranes pour vérifier) j'avais des bandes bleues sur les 3 membranes et encore des protéines sur mon gel, 2h 50V, pareil.. Je sais plus quoi faire.  [...] Si ton marqueur est transféré, c'est que le transfert fonctionne. Quelle quantité de B-actine déposes tu à migrer Parce que le rouge ponceau a une limite de détection de 250ng et il ne fonctionne pas terrible avec les membranes en PVDF.  [...]

[Biochimie] Western blot

Cependant une personne de mon équipe a réalisé un transfert d'une très grosse protéine (. 300 kDa) et il a un tampon de transfert adapté, pris d'une publie. Il réalise son transfert à 20V à 4°C et a noté une nette amélioration du transfert des marqueurs de haut poids moléculaire comparé aux méthodes classiques.  [...] très intéressante cette discussion. Effectivement, est-ce qu'il serait possible d'avoir la référence de la publication sur l'utilisation du tampon de transfert pour les grosses protéines.  [...]

[Biochimie] Questions Western Blot

Le pouvoir de mouillabilité de l'éthanol est tout de même inférieur à celui du méthanol, ce dernier étant plus hydrophile. J'étais passé pendant un certain temps à l'éthanol, que ce soit pour mouiller le PVDF ou transférer, et j'ai trouvé que l'efficacité du transfert était inférieure au transfert avec méthanol.  [...] - si l'activation de la membrane la rends hydrophile et est utile pour le transfert. pourquoi faudrait-il la réactiver avant de repasser un anticorps dessus.  [...]

[Biologie Moléculaire] Western Blot avec membrane PVDF

Je transférais mes protéines sur une membrane de nitrocellulose (transfert semi-sec avec Trans Blot Turbo System de Bio-rad) mais j'ai testé depuis peu la membrane de PVDF (même méthode de transfert). J'ai incubé mes membranes avec plusieurs anticorps primaires (toujours les même anticorps et 1 anticorps primaire/membrane).  [...] Etant dans l'incapacité d'utiliser à nouveau des membranes de nitrocellulose pour le moment, est ce que ce signal aspécifique peut provenir de la membrane de PVDF.  [...]

[Biochimie] bruit de fond western blot

La seule contrainte c'est qu'il faut mouiller la membrane dans du méthanol avant le transfert. Mais sinon moi je n'utilise plus que ça.  [...] Je confirme, méthanol pour mouiller la membrane c'est mieux, il suffit de tremper dans quelques ml sous la sorbonne, 30 sec juste histoire de mouiller la membrane, rien de si contraignant... Ensuite on peut la mettre à équilibrer dans le tampon de transfert pour lequel on utilise de l'éthanol.  [...]

[Biochimie] migration sds page

Je te conseille de transférer sur des membranes de PVDF préalablement mouillée dans du méthanol. La capacité de charge en protèïnes est plus importante (le double de la nitrocellulose).  [...] Sinon tu équilibres tes membranes avant le transfert (en fait je n'ai pas compris si tu coloriais tes gels ou tes membranes car si c'est les membranes ça peut-être un problème de transfert).  [...]

Antibiotiques : la guerre contre les bactéries en passe d'être perdue ?

Par transfert de gène horizontal, regroupant conjugaison, transduction et transformation, elles peuvent se transmettre entre elles cette capacité. À tel point qu' on a beau attaquer les voies métaboliques bactériennes, s'en prendre à la réplication de l' ADN ou détruire leur membrane cellulaire, à chaque fois que les scientifiques développent une arme nouvelle, les bactéries évoluent de telle sorte que les mêmes médicaments deviennent de moins en moins efficaces dans les années qui suivent, ajoute-t-il.  [...] Conscients de cette difficulté depuis des années maintenant, les scientifiques tentent d'élaborer des solutions alternatives. Ces derniers jours, un laboratoire britannique vient d'annoncer que son médicament permettant d'amplifier l' efficacité des antibiotiques contre le staphylocoque doré résistant va intégrer la troisième phase des essais cliniques, afin de vérifier son efficacité à grande échelle.  [...]

[Biochimie] le native PAGE !! et western blot "natif"

en effet j'ai une proteine positive à faire migrer pour cela j'avais inversé les bornes lors de l'electrophorèse afin qu'elle puisse migrer tranquillement vers le moins et pareil lors du transfert (sauf que la j'avais inversé la membrane et le gel) et le resultat à la fin est assez surprenant vu que mon anticorps semble detecter quelque chose mais ca ne donne pas des bandes mais on dirait juste une membrane degueu.  [...] Une photo pourrait peut être aider, c'est difficile a dire sans voir tes résultats, même si tu précise que c'est moche, c'est mieux de voir moche comment.   [...]