• Santé - Efficacité, Gamme, échantillon

[Biologie Moléculaire] Quantification absolue / gamme étalon

J'utilise la PCR quantitative, quantification absolue avec une gamme étalon obtenue par dilution de quantités connues d'ADN. Je cherche à déterminer les quantités d'ADN d'échantillons. Je travaille en SYBR Green. Mon efficacité de PCR et la spécificité de mes amorces sont OK.  [...] Il se peut en effet que mon efficacité de PCR soit différente pour la gamme étalon et pour l'échantillon.. L'ADN est extrait de bactéries et ces bactéries sont dans des matrices différentes pour la gamme étalon et pour l'échantillon.  [...]

[Biologie Moléculaire] PCR en temps réel

Sous reserve que votre quantité de matériel de départ est la même pour les deux échantillons, on peut effectivement comparer le niveau d'expression de la cible dans ces deux échantillons. Pour cela, pas besoin de la gamme, on compare le Ct de chaque échantillon à concentration identique, en prenant en compte l'efficacité de l'amplification.  [...] 1 Ct d'écart correspond à un rapport 2, 2 Ct d'écart à un rapport 4 dans le cas d'une efficacité de 100%. En réalité, on peut calculer ce rapport entre un échantillon et un témoin par cette formule.  [...]

[Biologie Moléculaire] Interprétation PCRq en temps réel (SYBER Green)

Ce raisonnement n'est valable que si la gamme a été effectué par des dilutions de raison 2, ton Efficacité traduit la différence de quantité d'échantillon entre chaque point de gamme. Donc si tu as réalisée une gamme de raison 4 tu aurais obtenu E=4.  [...] Dans le cas d'une quantification dite relative où n'est pas utilisée une gamme de cDNA, le calcule des quantités de cDNA peut alors être 2^-Ct si E=2 (une dilution de raison 2 des échantillons est alors réalisée, mais sans connaissance de la concentration de cDNA cible dans ce même échantillon).  [...]

[Biologie Moléculaire] Comment analyser les résultats de PCR quantitative???

] Faire une gamme par echantillon permettra de calculer l'efficacité de la PCR dans chaque echantillon sain, mais ne permettra pas de faire la quantification absolue car la quantité de cDNA correspondant au gène cible dans le tissu sain n'est pas connu.  [...] En quantité constante dans tous les échantillons, il normalisera les biais d'extraction ou de contamination et les variations d'efficacité éventuelles de la transcription inverse. Il donnera ainsi en quelque sorte une image de la quantité de matrice apporté (ADNc).  [...]

[Biologie Moléculaire] Gammes pour calcul de l'éfficacité de la RT-qPCR

dans le labo je fait mes calculs de quantité relative sans le calcul de l'efficacité, cet-à-dire, j'utilise E=2 (efficacité = 100%), mais si je veux faire ces calculs de la quantité relative avec la vrai éfficacité ( E differente de 2), je peux utiliser la même formule R=E^-deltaCp sauf que en se cas le E est differente de 2.  [...] c'est l'efficacité de la gamme de l'echantillons ou l'éfficacité de la gamme du gène de mènage.  [...]

[Biologie Moléculaire] qRT-PCR

Je dois faire une RT-PCR en temps réel et j'ai quelques questions. Au départ, je dois déterminer l'efficacité de mes primers en réalisant une gamme de dilution de mes cDNA pour chaque primer. Une fois l'efficacité déterminée, est ce qu'il me suffit d'utiliser cette valeur pour toutes les prochaines manips sans avoir à refaire de gammes ou la gamme est obligatoire pour la quantification j'avoue que je suis perdue.  [...] Après si vous avez un grand nombre d'échantillons à passer pour un gène donné il est admis de faire une gamme, d'en déterminer l'efficacité et d'utiliser un des points de gamme comme standard.  [...]

[Biologie Moléculaire] test d'efficacité de primers pour RT-qPCR

Pour ce faire ici les techniciens amplifient une gamme de dilution de primers sur toujours la même concentration de cDNA, et pas le contraire. J'ai toujours fait le contraire, tester l'efficacité d'amplification de mes primers à la concentration à laquelle je les utilise le long d'un gradient de cDNA.  [...] ..) je ne comprend pas ce qui cloche lors de ma manip, j'ai beau refaire plusieur fois, modifier ma maniere de pipeter, changer l'echantillons de la gamme, changer les Primers.. Je ne sais plus quoi fair, pouvez vous me donner des astuces pour avoir une bonne éfficacité de PCR.  [...]

[Génétique] q PCR: Ct trop variable

Voila comme j'ai beaucoup d'échantillons à tester, au labo, on a décidé de faire les tests de mise en route (amorces - gamme étalon) sur une machine 96 puits.  [...] Du coup j'ai re-testé sur la première machine je retombe sur mes premiers résultats et l'échantillon de gamme pur, qui ne donnait rien, marche de nouveau.  [...]

[Biologie Moléculaire] Plan de plaque, validation de méthode...

S'il s'agit de mesurer l'efficacité de la PCR en fonction du type d'échantillon, j'imagine que vous avez prévu de faire des gammes de concentrations pour chaque. Il est bien intéressant de faire des triplicates (et non des duplicates) pour chaque point (ou par exemple pour un point concentré et un plus dilué) pour déterminer la variabilité intra-expérimentale, de même que plusieurs blancs, par exemple avant et après la manipulation des échantillons d'ADN comme vous avez l'air de le suggérer.  [...] En ce qui concerne l'efficacité de la PCR a proprement dit, je ne vois pas ou vous voulez en venir. Cette efficacité étant dépendante du milieu réactionnel, on pourrait s'attendre à une variation entre les types d'échantillon et c'est peut être cela que vous voulez estimer dans quel but Vous pourrez peut-être voir si la variabilité inter-échantillons est inférieure ou supérieure a la variation intra-expérimentale.  [...]

[Biologie Moléculaire] Interprétation courbe qPCR

Nous utilisons une gamme pour comparer nos échantillons, si les valeurs obtenues n'entrent pas dans la gamme nous ne pouvons pas faire de comparaison... Et ces témoins négatifs à un CT de 30, sont à la limite de la gamme, puisqu'à 10^-8 le CT est de 28/30.  [...] J'ai relancé une plaque avec plusieurs témoins négatifs avec mes produits habituels d'un côté et des témoins nég avec des produits issus de tubes neufs de l'autre, avec un point de gamme et un échantillon, traités en triplicat avec les 2 mix.  [...]