• Santé - Efficacité, Amorces, Gamme

[Biologie Moléculaire] Gammes pour calcul de l'éfficacité de la RT-qPCR

dans le labo je fait mes calculs de quantité relative sans le calcul de l'efficacité, cet-à-dire, j'utilise E=2 (efficacité = 100%), mais si je veux faire ces calculs de la quantité relative avec la vrai éfficacité ( E differente de 2), je peux utiliser la même formule R=E^-deltaCp sauf que en se cas le E est differente de 2.  [...] L'efficacité est propre a un protocole donné, c'est à dire amorces, mix réactionnel et programme d'amplification. La seule façon de calculer l'efficacité d'une PCR est de faire une gamme de concentration en parallèle des échantillons pour chaque couple d'amorces utilisé.  [...]

[Biologie Moléculaire] Efficacité PCR temps réel

Il faut faire super attention avec l'efficacité dans les PCR en temps réel, qui dépend fortement de la façon dont tu places ton Ct (et le calcul de l'efficacité diffère parfois selon les machines. Notamment celui de Stratagène). Il peut arriver que tu aies des efficacités de 103, 104% voir plus.  [...] et pour l'efficacité des amorces je fait une gamme des dilutions au 1/25eme,donc est ce que ce juste de trouver une différence de Ct entre 4 et 5 cycles entre chaque 2 points (1/25 et 1/625 par exemple) ou svp comment faire.  [...]

[Biologie Moléculaire] Etapes de mise au point qPCR - gène peu exprimé

J'ai passé en qPCR tous mes couples d'amorces parallèlement à mes 2 gènes housekeeping préférés, sur des ADNc de cellules qui surexpriment mon gène en faisant des gamme de dilution de mes ADNc de 10-1 à 10-5. Grosse déception, seuls 2 couples sur les 6 designés ont eu une courbe de fusion acceptable, et une efficacité correcte.  [...] Par contre, 92% d'efficacité c'est trop peu. C'est qu'il y a des interférences. Mon seuil c'est 96% (famille de gènes très conservés oblige).  [...]

[Biologie Moléculaire] PCR en temps réel, (chimie Taqman)

et pour déterminer l'efficacité des amorces je fait une gamme des dilutions au 1/25eme,donc est ce que ce juste de trouver une différence de Ct entre 4 et 5 cycles entre chaque 2 points (1/25 et 1/625 par exemple) ou svp comment faire.  [...] mais pour moi j'utilise une gamme de dilution au 1/25eme. -1- -1/25 - -1/625- -1/5625- et 1/39625 mais le problème je n'obtient rien (cad pas de Cp) pour les dilutions -1/5625- et 1/39625 qui peut etre due à la quantité d'ADN, trés faible, donc pour tester l'efficacité de mes Primers est ce que je peut faire une autre gamme de dilution (plus faible) est d'après vous laquelle (dilution au 1/4eme ou laquelle...) que ce que tu pense,  [...]

[Biologie Moléculaire] Q-CPCR encore !

Maintenant une différence de 2x, c'est significatif si c'est reproductible, que tu as bien tenu compte de l'efficacité d'amplification de tes amorces (gamme de dilution en cascade).  [...] IngDr a raison, tu peux vérifier tout ça avec un gène de ménage. Tu peux même le cloner dans un plasmide et ainsi déterminer un nombre de copies d'ADN par volume. Tu réalises ensuite une gamme et ainsi tu pourras poser des valeurs sur l'expression de ton gène grâce à la Q-PCR et ton gène de ménage.  [...]

[Biologie Moléculaire] Quantification absolue / gamme étalon

J'utilise la PCR quantitative, quantification absolue avec une gamme étalon obtenue par dilution de quantités connues d'ADN. Je cherche à déterminer les quantités d'ADN d'échantillons. Je travaille en SYBR Green. Mon efficacité de PCR et la spécificité de mes amorces sont OK.  [...] Il se peut en effet que mon efficacité de PCR soit différente pour la gamme étalon et pour l'échantillon.. L'ADN est extrait de bactéries et ces bactéries sont dans des matrices différentes pour la gamme étalon et pour l'échantillon.  [...]

[Biologie Moléculaire] Interprétation courbe qPCR

J'effectue des qPCR sur des matrices intestinales, j'utilise 2 amorçes universelles pour bactérie (16S), ma gamme a un MT compris entre 84 et 85.5, avec une efficacité comprise entre 90 et 110%.  [...] Quant à savoir exactement pourquoi, je vous ai donné 2 des plus grosses pistes qui causent des dimères. Avez vous répété votre manip Si ce n'est pas encore le cas, il peut simplement s'agir d'un erreur de pipetage lorsque vous mettez vos amorces dans les puits.  [...]

[Biologie Moléculaire] qRT-PCR

Je dois faire une RT-PCR en temps réel et j'ai quelques questions. Au départ, je dois déterminer l'efficacité de mes primers en réalisant une gamme de dilution de mes cDNA pour chaque primer. Une fois l'efficacité déterminée, est ce qu'il me suffit d'utiliser cette valeur pour toutes les prochaines manips sans avoir à refaire de gammes ou la gamme est obligatoire pour la quantification j'avoue que je suis perdue.  [...] Après si vous avez un grand nombre d'échantillons à passer pour un gène donné il est admis de faire une gamme, d'en déterminer l'efficacité et d'utiliser un des points de gamme comme standard.  [...]

[Biologie Moléculaire] Interprétation PCRq en temps réel (SYBER Green)

Ce raisonnement n'est valable que si la gamme a été effectué par des dilutions de raison 2, ton Efficacité traduit la différence de quantité d'échantillon entre chaque point de gamme. Donc si tu as réalisée une gamme de raison 4 tu aurais obtenu E=4.  [...] L'efficacité n'est qu'un moyen mathématique de voir si ton coefficient est proche du coefficient parfait d'une gamme d'étalonnage. Et comme l'interprétation du coefficient est aussi facile à faire que la lecture des astres.  [...]

[Biologie Moléculaire] Preparation d'une gamme étalon ou standard pour PCRq

Moi, je veux quantifier un gène considéré comme bioindicateur, donc j'ai les amorces (dégénérées avec les séquences connues) ou je peux commander, mais mon probleme je n'ai pas une gamme standard OU 2TALON.  [...] en plus il faut pour ca que. L'efficacité PCR doit être la même sur le standard ou sur les échantillons. l'efficacité (que j'appelle E dans le message précédent) ne sera pas la même dans ton standard (une seule séquence, correspondant un certain nombre de tes primers) et dans tes echantilons (plusieurs variants de séquence donc plus de fixation et d'amplification).  [...]