• Santé - Digestion, Vecteur, Enzymes

Confirmation de l'insertion d'un gène dans un plasmide

Je travaille actuellement sur un clone et je veux savoir s'il est possible de confirmer une ligation entre un gène et un vecteur plasmidique et par quelle méthode puis¬je la faire.  [...] Oui c'est toujours comme cela que l'on fait d'ailleurs. On établit la carte de restriction du plasmide en utilisant des enzymes de restriction. A minima, une enzyme de restriction qui ne coupe qu'une fois permettra de linéariser le vecteur et d'en trouver la taille en faisant migrer le produit de digestion dans un gel d'agarose.  [...]

suggestions sur clonage site de restriction

je voudrais insérer mon insert dans un vecteur pcDNA. une digestion avec 2 enzymes de restriction EcoRI et XbaI a permis d'extraire mon insert contenu dans un vecteur de clonage pGEM et d'autre part de linéariser le pcDNA vide.  [...] L'insert et le vecteur ayant des extrémités cohésives, il est possible après qu'elles se soient reconnues, de les lier l'une à l'autre par une réaction de ligation.  [...]

[Biologie Moléculaire] Enzymes de restriction sur plasmides- Digestion complète et incomplète

.. bref, pour tout un tas de raisons. Et comme on ne maitrise jamais parfaitement chacun de ces paramètres, on ne peut pas non plus prévoir si la réaction sera complète ou non. Surtout si plusieurs enzymes différentes sont utilisées pour chacun des sites. Après, si on fait un électrophorèse, on peut quantifier l'avancement de la digestion pour chacun des sites, car en général, les différents fragements n'ont pas la même taille.  [...] aussi je cherche a savoir comment trouver la taille du vecteur pSK (environ 2900 pb) abres la double digestion par ces deux mêmes enzymes.  [...]

[Biologie Moléculaire] Probleme de clonage avec pT7Blue

une étape de digestion (ouverture) de ton vecteur plasmidique (là où tu as inséré ton produit de PCR) par diverses enzymes de restriction.  [...] [* ]Ligation reaction. réaction de ligation, C'est à dire que tu as dû utiliser une enzyme qui a collé les extrémités de ton vecteur à celui de ton produit de PCR.  [...]

[Biologie Moléculaire] Probleme de ligase?

2)Pour le vecteur tu propose donc que je digère avec mes enzymes, que je traite à la phosphatase (pour éviter une religation je suppose), que je fasse une extraction au phénol, et qu'ensuite je me serve de cela (avec l'insert bien entendu) pour faire la ligation.  [...] La PO4ase alcaline d'intestin de veau (CIP) fonctionne très bien dans tous les tampons d'enzymes de restriction. Pour déphosphoryler un vecteur, j'ajoute une pouillette (0.5 ul sans me poser de question, c'est toujours un large excès) de PO4ase directement dans la réaction de digestion 1/2 heure avant la fin de ma réaction de digestion et je termine l'incubation.  [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage

Et je bloque à cette étape. j'obtiens autant de clones pour mes bactéries transformées par le vecteur linéarisé que par celles transformées par le plasmide natif. J'en ai donc déduit une mauvaise digestion. Or, j'utilise les enzymes Fast Digest de chez Fermentas pour une digestion o/n.  [...] Si tu peux fais des doubles digestions avec des enzymes n'ayant pas d'extrémité compatible pour éviter que ton plasmide ne se re-ligue sur lui même (Si possible biensure).  [...]

[Biologie Moléculaire] Sites de restrictions proches sur vecteur

L'argument de. avec un clonage orienté, je n'ai pas de religation possible de mon vecteur sur lui même, et donc moins de bruit de fond. De même pas besoin de faire de déphosphorylation du vecteur, est juste théoriquement, mais dans la pratique, chacune de tes 2 enzymes ne coupant pas exactement à 100%, tu aurais toujours des vecteurs simplement digérés qui se religueront sur eux mêmes.  [...] Piwi, technique élégante, petite question. le vecteur avec le MCS modifié, tu l'amplifie en bactérie avant de refaire la digestion par XhoI, ou bien tu enchaines les différentes étapes, car si tu amplifies en bactérie, comment fais tu pour discréminer un clone avec un MCS modifié d'un clone avec le MCS normal La différence de taille après digestion par d'autres enzymes ne me semblant pas vraiment jouable, je pencherai plus sur l'introduction d'un nouveau site de clivage non présent dans le vecteur, ce qui facilitera le screening pour trouver les clones modifiés.  [...]

[Biologie Moléculaire] pcr sur colonies clonage

Quand je clone, je crible mes clones sur colonies et je ne séquence que 2 ou 3 clones qui sont positifs en PCR. D'ailleurs j'utilise toujours une amorce dans l'insert, l'autre dans le vecteur pour être sûr de la nature de mon vecteur, de mon insert, de la taille de mon insert et de sa position dans le vecteur.  [...] J'ai utilisé la kit Qiagen avec succès pour extraire mon produit de PCR du gel d'électrophorèse. En revanche, je ne connais pas les autres kits. Je n'ai pas fait de clonage depuis maintenant deux à 3 ans, mais dans mon souvenir, je ne faisais pas de purification après la digestion, mais la ligation directement.  [...]

[Biologie Moléculaire] Protocole pour une ligature + tranformation ?

Voilà, je continue gaiement mon stage à Barcelone, mais maintenant j'ai un petit souci. je dois faire une construction plasmidique toute simple, donc digestion de l'insert et du vecteur par 2 enzymes de restriction, ligature, et puis transformation de bactéries E. coli.  [...] Ah oui, et j'ai dû déphosphoryler mon vecteur aussi. Je sais que c'est pas vraiment la peine quand on digère avec 2 enzymes différentes, mais ma maître de stage semblait y tenir, au cas où une des 2 enzymes n'aurait pas bien coupé (cela ne peut pas se voir sur un gel).  [...]

clonages

j'ai quelques questions techniques à propos des clonages. Lorsque l'on utilise 2 enzymes de restriction qui nécessitent la digestion sequentielle du vecteur, j'imagine que vous précipitez le plasmide entre les deux digestions enzymatiques Purifiez vous l'insert avant la ligation avec le plasmide Moi je ne purifie pas parce que je trouve qu'une gel extraction ou une précipitation fait perdre bcp d'insert, surtout que je précipite déja entre les deux digestions enzymatiques.  [...] pour la premiere question, ca depend des tampons utilisees pour les deux enzymes. Si ils ont compatibles (cf catalogues du distributeur), pas besoin de purifier, on peut meme metre les deux enzymes ensembles.  [...]