• Santé - Digestion, Produit, Plasmide

[Biologie Moléculaire] comment faire une mutation par PCR? - Page 2

Après digestion du produit pcr, on transforme direct. Le plasmide se referme comment Dans les DH5a.  [...] ça c'est la question qu'on se pose tous au début. En fait c'est la bactérie qui fait le boulot après transfo, elle répare les nicks.   [...]

[Biochimie] Mecanisme de ligation SOS clonage

Ceci dit jusque la je compte pas trop sur le clonage avec l insert issue de la digestion du produit PCR parceque j ai des constructions deja faites par des etudiants qui ont passé jadis par le labo à savoir le plasmide PLIP6-P30 et le PET22b(+)- P30 et donc je recupére mon gene d interet qui code pour la P30 à partir de ces constructions.  [...] L'avantage par rapport au produit PCR est que la on peut controler la digestion (passage du circulaire au lineaire) chose pas possible avec le produit PCR, donc jusque la j ai cloner avec l'INSERT issue de la double digestion à patir du plasmide,la derniére fois le dosage de cet insert purifié est de 10.2ng/ul.  [...]

[Biologie Moléculaire] Problème de tranformation

J'ai vérifié mon produit PCR sur gel, bande bien intense et à la bonne taille. J'ai ensuite fait ma digestion du pcDNA et de mon insert avec XhoI et Hind III, puis ma ligation. J'ai vérifié sur gel et purifié la bande contenant mon plasmide + insert (jusqu'ici tout va bien...).  [...] J'ai donc changé de plasmide et de souches et utilisé TOPO-TA avec les bactos One-shot (tout chez invitrogen, encore...). même protocole sauf que j'ai utilisé la Taq en plus en fin de PCR pour rajouter les A nécessaire à la ligation dans TOPO et je n'ai pas digéré puisque la ligation se fait avec les poly A.  [...]

[Biochimie] Mutagénèse dirigée

As-tu plutôt digéré ton plasmide (DpnI avec plasmide) puis fais une étape de ligation pour lier ton produit de PCR au plasmide (avec une ligase).  [...] Je fais donc effectivement la digestion sur mon produit de PCR qui n'est autre que mon plasmide...(en théorie, si tout se passe bien).  [...]

plasmide -digestion par enzymes de restriction

On me dit que je dois dessiner un plasmide après sa digestion par Xho I et Nco I (déterminer les extrémités du plasmide) et je suis incapable de le faire parce-que je comprends ce que je dois faire ni quels outils utiliser.  [...] Tu digères un plasmide lorsque tu veux modifier ce dernier, y rajouter un fragment ou en retirer un. On passe avant tout par cette étape de digestion. Après tu as un étape de ligation si éventuellement tu veux recirculariser le plasmide après y avoir insérer un fragment entre XhoI et NcoI.  [...]

[Biologie Moléculaire] Carte de restriction

Il doit y avoir un souci dans vos données. Normalement, l'ensemble des fragments produits pas une digestion doit vous reconstituer le plasmide natif. D'où vient le fragment de 8000 pb quand on parle d'un plasmide de 4300 pb.  [...] Je me base à la graduation donnée par un marqueur de taille Smartladder Eurogentec qui contient des fragments de 200 400 600 800 1000 1500 2000 2500 3000 4000 5000 6000 8000 10000. Je suis parti du fait que la marque 10000pb est celle la plus proche des puits de dépot (ai-je bien fait).   [...]

[Biochimie] Clonage après purification sur gel

J'ai testé plusieurs protocoles de digestion du plasmide et de l'insert (de 4h à O/N de digestion). Déphosphorylé ou non pour le vecteur.  [...] Votre approche est interessant mais pas applicable dans mon cas. L'intérêt de la k7 de resistance de 2000 pb est un témoin de digestion du phagemid. Dans votre stratégie, au lieu de purifié un produit de digestion, je puriferais sur gel un produit PCR. Je garde cela en tete mais je doute.  [...]

[Biologie Moléculaire] Mutagénèse dirigée

Dans ce kit le contrôle positif de la mutagénèse utilise un plasmide Whitescript de 4,5 kb. Après la mutagénèse et la digestion des produits par l'enzyme Dpn1, je fait un gel de 0,8% agarose pour vérifier avant la transformation si ma mutagénèse à marché.  [...] ...Seulement là j'ai un petit soucis parce que dans mon contrôle (plasmide whitescript) et dans mon echantillon, tout ce que je dépose sur mon gel reste dans le puit...(je dépose 5µl de produit de PCR).  [...]

[Microbiologie] transformation

je dois cloner les produits de digestion de la mutagenèse (insert ADN) dans le vecteur PGEX4T1 en transformant les bactéries compétentes DH5± J'ai trouvé des clones sur un milieu 2YT/AMP j'ai fait une miniprep pour extraire le plasmide recombinant simplement sur le gel les produits sont piégés dans le puits j'ai refait la manip à plusieurs reprises je trouve toujours le même résultat avec un smear Aidez moi que devrais je faire.  [...] Je vérifie mes preps en faisant migrer sur gel directement...si c'est fait proprement, je ne vois pas en quoi c'est dérangeant. Bien sûr la bande est ondulée, smear sur les bords...mais ça confirme bien l'extraction du plasmide (la double confirmation serait la digestion, la triple, une pcr.  [...]

[Biotechnologie] Construction plasmidique

Ensuite digestion des amplifiats obtenues par des enzymes encadrant le gène, et correspondant à là où tu veux le mettre dans ton nouveau plasmide, afin de le récupérer. Par contre si par construction plasmidique tu entend, logiquement, construire un plasmide entier, alors là lors de l'amplification des parties géniques sur des plasmides de stockage, les primers que tu utilise doivent posséder une partie liant le template et une partie non liant appelée overlap, d'au moins 40bp.  [...] Suite à cela, ne pas oublier de désaler le produit résultant de gibson assembly si tu fais la transformation bactérienne ensuite par électroporation. Donc maintenant transformation de tes produits dans des bactérie compétente. Puis culture. Puis miniprep. Puis digestion pour voir si ta les bons plasmides dedans, puis t'envoi donc les bon clones au séquençage.  [...]