• Santé - Digestion, Plasmide, Enzyme

plamide repris en EDTA et digetion enzymatique

J'ai extrait un plasmide que j'ai repris dans du tris-EDTA. Ensuite, j'ai digéré celui-ci par une enzyme de restriction mais mon ADN est complètement dégradé. Après avoir fait des tests, des vérifs et de la lecture, il s'avère qu'il ne faut pas de présence d'EDTA pour une digestion enzymatique.  [...] J'ai fait un test. j'ai refait une digestion avec le plasmide repris en EDTA mais je n'ai pas mis d'enzyme. Résultat. mon ADN est dégradé par le tampon, je l'ai fait avec les kits de deux fournisseurs. Il ne s'agit donc pas d'activité STAR, car il n'y pas d'enzyme.  [...]

Carte de restriction d'un plasmide

Des digestions avec une ou 2 enzymes sont réalisées, les produits de la digestion sont soumis à une électrophorèse. On dtermine pour chaque puits le nombre et la taille des fragments de restriction par comparaison avec la migration de fragments d'ADN de taille connue. Les résultats sont dans le tableau suivant.  [...] Question confuse. Dans un plasmide recombinant on a un vecteur et un insert. L'ADN génomique humain a une taille d'environ 3 000 000 000 Nt. Mais je suppose que c'est la taille de l'insert du plasmique recombinant que tu veux.  [...]

calcul dilution plasmide

dans le protocole que j ai en nous demande de prendre 5ug du plasmide la concentration de mon plasmide quand je l ai verifier au nanodrop est de 43ng/ul.  [...] ou carrément reconcentre mon plasmide car sa donne 116ul et le volume final dans le protocole doit etre de 100ul donc c impossible.  [...]

[Biologie Moléculaire] Utilisation de Klenow

Je viens de digerer un plasmide (pour le lineariser) avec une enzyme creant des bout cohesifs (extremite 5' depassant). Je voudrais rendre cette extrimite blunt en utilisant une klenow.  [...] il faut inactiver l'enzyme préalablement, sinon elle va continuer a couper. Pas besoin de purifier le plasmide, tu peux le faire ensuite. Il faut quand même que la klenow puisse fonctionner dans le tampon utilisé pour la digestion.  [...]

[Biologie Moléculaire] Mutagénèse dirigée

Je suis étudiante en M2 et je suis en train d'essayer de faire une mutagénèse dirigée sur un plasmide de 11kb. Pour cela j'utilise un kit approprié pour ce genre de cas, Quikchange XL Site-directed mutagenesis kit de stratagene.  [...] Dans ce kit le contrôle positif de la mutagénèse utilise un plasmide Whitescript de 4,5 kb. Après la mutagénèse et la digestion des produits par l'enzyme Dpn1, je fait un gel de 0,8% agarose pour vérifier avant la transformation si ma mutagénèse à marché.  [...]

clonage qui ne fonctionne pas ? ratio ?

Voici brievement le protocole, digestion du plasmide par une enzyme qui génere des extrémités cohésives (pacI), puis purification des deux fragments à partir d'un gel d'agarose QIAEXII.  [...] Je n'ai pas essayé de déphosphorylé, cependant, j'essaye actuellement en parallele un clonage qui ne necessite pas de déphosphorylé le plasmide (digestion par deux autres enzymes generant des exttrémités non compatible afin que le vecteur ne se referme pas).  [...]

[Génétique] Electrophorèse d'un plasmide avec 5 bandes

Le plus simple à mon avis, c'est qu'il y ait plusieurs formes plus ou moins sur-enroulées (topoisomères). Pour le confirmer, essaie de regarder s'il ne reste qu'une seule bande après digestion par une enzyme qui ne coupe qu'une fois dans ton plasmide.  [...] Le coup du plasmide simple brin n'est jamais évoqué dans les cours alors qu'il est relativement fréquent d'en sortir lors des preps. Il passe inaperçu lors d'un clonage classique vu que la bactérie va s'empresser de synthétiser le complémentaire. Le problème c'est que cet abruti ne peut pas être coupé par les enzymes de restriction.  [...]

[Biologie Moléculaire] Mutation par PCR

Le plus simple, pour faire ces types de clonages est de faire une PCR dite divergente. En gros, tu utilises un primer qui contient la mutation voulu (à l'extrémité 5') et le reste identique au plasmide (au moins 15 bases) et un autre primer dans le sens complémentaire et qui commence à la base juste avant la mutation.  [...] Ensuite, tu purifies sur gel tes PCR. Tu fais une digestion avec une enzyme DpnI pendant 3h, elle permet de cliver uniquement des séquences méthylées qui ne sont présentent que dans le plasmide d'origine vu que tu n'as pas de méthylation sur le brin néosynthétisé.  [...]

microbiologie - CARTE DE RESTRICTION

prends ton plasmide et effectue des digestions avec une enzyme de restriction particulière (eco R1 par exemple) ensuite fait ton gel et fait migrer ton produit de digestions.  [...] Le résultat de la digestion avec l'enzyme 2 t'indique qu'elle coupe le plasmide 1 fois mais tu ne peux pas placer son site par rapport aux sites E1.  [...]

Confirmation de l'insertion d'un gène dans un plasmide

Comme sur un gel d'électrophorèse par exemple. J'ai pensé à ca mais je ne suis pas très sûre du résultat, je devrai visualiser juste une seule bande, sachant que la taille de mon gène est de ~880pb et le plasmide que j'utilise est de ~7900pb donc en principe j'aurai une bande de ~8700pb. Est¬ce une méthode correcte.  [...] Oui c'est toujours comme cela que l'on fait d'ailleurs. On établit la carte de restriction du plasmide en utilisant des enzymes de restriction. A minima, une enzyme de restriction qui ne coupe qu'une fois permettra de linéariser le vecteur et d'en trouver la taille en faisant migrer le produit de digestion dans un gel d'agarose.  [...]