• Santé - Digestion, Plasmide, Enzyme, Extrémités

clonage qui ne fonctionne pas ? ratio ?

Voici brievement le protocole, digestion du plasmide par une enzyme qui génere des extrémités cohésives (pacI), puis purification des deux fragments à partir d'un gel d'agarose QIAEXII.  [...] Je n'ai pas essayé de déphosphorylé, cependant, j'essaye actuellement en parallele un clonage qui ne necessite pas de déphosphorylé le plasmide (digestion par deux autres enzymes generant des exttrémités non compatible afin que le vecteur ne se referme pas).  [...]

plasmide -digestion par enzymes de restriction

On me dit que je dois dessiner un plasmide après sa digestion par Xho I et Nco I (déterminer les extrémités du plasmide) et je suis incapable de le faire parce-que je comprends ce que je dois faire ni quels outils utiliser.  [...] Je suis désolée mais je comprends pas ce que je dois faire... J'ai bien compris que si on coupe un plasmide circulaire via une enzyme de restriction il devient linéaire mais les extrémités c'est quoi.  [...]

clonage

Le clef c'est la qualite de la digestion. Le mieux (et de tres loin d'apres mon experience) c'est de faire tes digestions une seule enzyme a la fois, dans 50 ul final, en utilisant au maximum 40 u d'enzyme (pas plus de 2 ul) et en incubant 2-3h a la temperature indiquee par le fabricant.  [...] Ensuite, une purif et la meme chose avec la 2 eme enzyme, puis Re-purif, puis ligation O/N (perso j'utilise pas plus de 20 ng de plasmide avec un ratio compris entre 3/1 et 10/1).  [...]

[Biologie Moléculaire] Contrôle négatif clonage

Comme tu l'as dit. plasmide + ligase = voir les plasmides mal digérés, mal déphosphorylés. Si la ligase est mauvaise, un faible nombre de bactéries transformées sera peu représentatif de l'efficacité réelle de la digestion et surtout de la déphosphorylation. On peut alors partir sur une fausse piste.  [...] Par contre, je suis d'accord avec le fait que mettre l'insert n'est pas absolument nécessaire. Un contrôle plasmide digéré + ligase en ayant fait un gel rapide pour vérifier que la digestion est totale est suffisant pour vérifier l'activité ligase. Dans ce cadre, la déphosphorylation ajoute une inconnue énorme puisqu'avec ce contrôle on ne peut pas faire le différentiel entre un plasmide mal déphosphorylé, un plasmide trop déphosphorylé où les extrémités ont commencé à être dégradées par CIP et qui n'est pas ligable, et une activité ligase faible.  [...]

génie génétique

Bonjour à tous, lorsque l'on veut insérer un fragment de restriction dans un plasmide pour pouvoir produire des clones, si ce fragment a 2 extrémités identique il pourrait se combiner avec extrémité du plasmide dans un sens aussi bien que dans l'autre alors comment grâce à enzyme de restriction peut-on choisir dans quel sens on veut que ce fragment se positionne.  [...] donc en gros l'enzyme de restriction coupe le plasmide d'un côté et le fragment de restriction d'un coté, les autres cotés sont intacts et les coté coupés s'emboitent.  [...]

[Biologie Moléculaire] Sites de restrictions proches sur vecteur

Je dois cloner un cDNA dans un vecteur pET-15b (cf pièce jointe). J'ai choisi de faire un clonage orienté, ne pouvant pas utiliser NdeI qui clive mon cDNA, j'ai choisi XhoI et BamHI. Mais comme vous le voyez sur la carte du plasmide, ces deux sites sont accolés de telle façon que lorsque XhoI clive sa séquence (C/TCGAG), celle de BamHI (G/GATCC) se trouve à l'extrémité de l'ADN, avec même pas une base avant son site.  [...] Sinon j'avais pensé à une solution un peu compliquée et probablement peu fiable. Digérer le vecteur avec ma première enzyme (XhoI). Liguer aux extrémités cohésives des linkers s'hybridant avec les extrémités cohésives puis faire une digestion avec la deuxième enzyme (BamHI) qui ainsi aurait un support convenable, et la première enzyme évidemment pour recréer l'extrémité voulue de l'autre côté. Un schéma aurait été le bienvenue...désolé.  [...]

[Biologie Moléculaire] Protocole digestion

Une question. quelle quantité d'ADN plasmidique devrais-je mettre Mon plasmide a une concentration de 150 ng/ul, j'ai fait mon calcul pour le nombre d'unités d'enzyme pour 1 ug d'ADN plasmidique. Est-ce une quantité cohérente (mon clonage ultérieur sera un peu ch****).  [...] Je vais donc faire une digestion en 2 lots. l'un avec NcoI, l'autre avec BamHI. Après le gel, j'inverse les lots et les digère avec l'autre enzyme. Enfin, clonage. je vais commencer par cloner le bout Cter contenant le site BamHI, puis je clonerai le Nter entouré par les deux extrémités NcoI.  [...]

[Génétique] Intégration ADNc

je ne comprends pas pourquoi le fait d'utiliser deux enzymes de restriction lorsque l'on veut insérer un ADNc dans un plasmide permet de contrôler le sens d'intégration de cet ADNc.  [...] Même si tu peux aussi couper ton plasmide avec une ou 2 autres enzymes qui génèrent des extremités cohésives compatibles avec celles de ton insert. C'est-à-dire que tu peux avoir un site de restriction reconnu par une enzyme différente mais une fois la coupure faite, l'extremité genérée est compatible avec celle de ton enzyme.  [...]

[Biologie Moléculaire] Ligation

sur ce genre de manip c'est souvent la digestion du produit de PCR qui s'effectue mal. en effet les enzyme ont des difficulté pour coupes aux extremites un fragment d'ADN linéaire.  [...] Je digère en deux étapes le plasmide avec SpeI et SacII (je déphosphoryle vers la fin de la deuxième digestion en ajoutant CIAP) et je l'extrait du gel, je le purifie. (j'ai tout vérifié et ai essayé par digestions croisées) Le plasmide semble apte à recevoir l'insert.  [...]

[Génétique] clonage orienté ou non

Comme on le voit ici, cette enzyme coupe spécifiquement les sites methylés. Cette methylation ne survient qu' in vivo dans les organismes vivants. Donc dans une PCR faite sur un plasmide seul ce dernier est methylé. Vous ne coupez que le plasmide et ne conservez que votre fragment de PCR.  [...] Depuis que je connais cette astuce je n'envisage plus un clonage à partir d'un plasmide sans une étape digestion par DpnI. A connaitre.  [...]