• Santé - Digestion, Fragment, ADN

[Génétique] hybridation adn/adn : technique de southern blot

Par contre je n'ai pas bien compris le rôle du tampon 10x. S'agit-il bien d'un tampon permettant l'activation de l'enzyme en question Dans ce cas, une quantité insuffisante de ce tampon expliquerait - il une digestion incomplète de l'enzyme, d'où le fait que j'obtienne des fragments trop gros restant coincés en haut du gel comme tu l'as dit.  [...] Donc dans ce cas, le fragment d'ADN visible au puit 4 à déjà été digéré. puisqu'en regardant ma carte de restriction, je constate que EcoRI permet d'obtenir un fragment de 21 226 pb. Pourtant mon puit 4 ne contient pas d'enzyme, donc pas de digestion possible.  [...]

[Biologie Moléculaire] Electrophorèse en gel d'agarose pGFP

J'ai réalisé sur un plasmide pGFP une extraction classique puis un traitement à la Rnase et parallèlement une digestion avec BamHI.  [...] puis sur la deuxième piste avec la digestion des ARN contaminants et un seul fragment, correspondant à de l'ADN sous forme linéaire, puisqu'il n'y a.  [...]

[Biologie Moléculaire] Ligation

sur ce genre de manip c'est souvent la digestion du produit de PCR qui s'effectue mal. en effet les enzyme ont des difficulté pour coupes aux extremites un fragment d'ADN linéaire.  [...] j'ai eu le meme probleme il n'y a pas longtemps avec un insert de 7 kb (oui 7000 pb.). Je suis passé par un vecteur de sous clonage type TOPO TA cloning et je l'ai ressorti et cloné nickel. C'etait donc bien un probleme de digestion de mes fragments au départ (malgré les nucléotides supplémentaires rajoutés lors du design en 5').  [...]

recherche d'un contact par mail avec un laborantin

En fait il n'y a pas moyen de différencier votre ADN du mien juste par électrophorèse. L'électrophorèse ne permet que de séparer des fragments d'ADN selon leur longueur (qui est proportionnelle à leur charge d'où les différences de migration sous l'action d'un champ électrique).  [...] On détermine les micro-satellite de l'ADN à l'aide de technique de digestion (comme tu le dis toi même, en coupant l'ADN aux bons endroits), ou de PCR (amplification des centaines de milliers à des millions de fois d'un petit fragment, le microsatellite), puis on fait migrer l'ADN sur gel, révélation (aux UV généralement), et hop, on a nos différentes barres.  [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage

J'ai besoin d'aide pour un clonage. Je dois cloner un fragment d'ADN génomique bactérien dans un plasmide. La stratégie choisie est de linéariser le vecteur par digestion enzymatique, de le purifier sur gel, de le déphosphoryler et de faire la ligation avec l'insert.  [...] Comment fais tu ta digestion En rajoutant toute la quantité d'enzyme d'un coup Moi, je diminue la quantité d'enzyme par deux et j'en rajoute à la moitié du temps de digestion pour diminuer son essoufflement.  [...]

[Biologie Moléculaire] Construction Banque ADNc

Normalement c'est le fragment de Klenow qu'on utilise généralement sous le terme ADN pol I, non L'ADN polymérase I est une enzyme qui d'une part polymérise l'ADN à partir d'une matrice mais qui d'autre part coupe l'ADN grâce à son activité exonucléasique 5'-3'.  [...] Je vous avoue être embrouillé sur la question car on nous a dit que la RNAse agit par à-coups (là où la méthode chimique à la soude est agressive et détruit tout l'ARN d'un coup) et induit une série de cassures dans l'ARN, mais si c'est à la manière du NaOH, une ADN Pol I véritable (donc pas Klenow) ne conviendrait pas. Ou je me trompe.  [...]

[Biologie Moléculaire] Plasmide ligature

les questions precedentes portent sur la coupure par BgIII d'un fragment d'adn, de la digestion d'un plasmide avec BamH1, et de la sequence obtenue apres ligation au niveau des jonctions vecteur/insert et insert/vecteur. la question est. Ces jonctions peuvent elles etre recoupées par BamH1 et/ou BgIII.  [...] Maintenant la ligation est peut être réalisée en bout franc et donc ne tient pas compte des digestions qui ne servent qu'a définir l'emplacement. Dés lors on ne pourra pas redigérer le plasmide reformé avec les mêmes enzymes.  [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage en plasmides de grande taille via Sfi I (astuces)

la digestion je la fais géneralement avec 1,5 µl d'enzyme 1Hà 37°C. mais comme le signal obtenu après dépos sur gel est trop faible, j'ai augmenté la quantité d'ADN digeré (80µL dans 350 final) avec 5µl d'enzyme de digestion 1h 37°C(j'ai essayé d'amplifier le fragment par pcr, ça ne marche pas).  [...] après dépos sur gel le signal raltif à mon fragment d'interet reste faible (rapport incorrect avec l'autre fragment )mais les bandes plus visibles pour faire l'élution des bandes(kit gel extraction). j'ai déposé un aliquot à la fin d'élution j'ai eu encore un signal très faible (21ng/µL).  [...]

[Biologie Moléculaire] Polymorphisme et RFLP

Par exemple, les RFLP sont des polymorphisme de longueur des fragments de restriction... c'est donc juste la variabilité de longueur de fragment d'ADN après digestion enzymatique Rien de plus complexe.  [...] Dans ce cas ce qu'il faut voir c'est que l'enzyme de restriction coupe l'ADN en un certain endroit, qui contient un certain motif. Si la longueur du fragment est différente c'est que le motif n'est pas au même endroit, ou encore que le motif attendu à l'endroit usuel n'existe plus, donc c'est qu'il y a une mutation quelque-part dans le motif.  [...]

[Biologie Moléculaire] Enzymes de restriction VS fragment d'ADN

J'ai une petite question concernant le mode de fonctionnement d'une enzyme de restriction lors de la digestion d'un fragment d'ADN.  [...] Combien de paires de bases nécessite une enzyme de restriction de part et d'autre de son site de reconnaissance afin qu'elle puisse opérer la coupure du fragment dans les meilleures conditions.  [...]