• Santé - Digestion, Enzyme, Vecteur

[Biologie Moléculaire] Construction d'une banque d'ADNc

Donc, en fait quand on fait un criblage la banque est détruite. Si l'on veut utiliser le vecteur qui contient l'ADNc d'interrêt il faut re-transfecter des bactéries Ai-je bien compris.  [...] Ta banque ne contient pas des cellules. tu te fiches des cellules en gros. Ta banque contient les fragments de ton ADN d'intérêt insérés dans des vecteurs (plasmides, cosmides, YACs, BACs,...). Donc, non, ta banque n'est pas détruite. les cellules portant les vecteurs sont détruites, mais tu le fais dans le but d'extraire ces vecteurs justement Donc, si tu veux utiliser l'ADN contenu, tu peux.  [...]

[Biologie Moléculaire] Ligation Vecteur/insert après traitement CIP

j'ai une petite question de BM à vous poser car je bloque... voilà je fais actuellement du clonage dans mon labo, après digestion de mon insert et de mon vecteur avec une enzyme appropriée je CIP mon vecteur. J'aurai voulu savoir quel est le mécanisme de cette enzyme pour retire le 5'P et qu'il y ait un 3'OH à la place.  [...] Après, pour la ligation, je ne comprends pas comment elle peut avoir lieu entre l'insert et le vecteur si on a plus de 5'P au vecteur. La ligase utilise t'elle de l'ATP présent dans les buffer pour refaire des 5'P pour la ligature.  [...]

[Biologie Moléculaire] précipitation de l'ADN diminution de la taille de mon fragment!!!

je digère un vecteur d'environ 6000pb avec une enzyme de restriction qui coupe une seule fois dans ce vecteur. je vérifie ma digestion sur gel d'agarose...une belle bande à 6000pb. je décide de précipiter (avec de l'éthanol) l'ADN sur la nuit. le lendemain, je re-dépose sur gel.  [...] tu as un vecteur de 6kb que tu as ouvert. A ce moment, ton gel te confirme sa taille de 6 kb. Après une nuit dans de l'éthanol, ce même plasmide ne fait plus que 2kb. Tu récupères ce fragment, tu l'intègres dans un autre vecteur, puis tu fais une PCR sur ce fragment, et là 1kb.  [...]

[Biologie Moléculaire] Sites de restrictions proches sur vecteur

Sinon j'avais pensé à une solution un peu compliquée et probablement peu fiable. Digérer le vecteur avec ma première enzyme (XhoI). Liguer aux extrémités cohésives des linkers s'hybridant avec les extrémités cohésives puis faire une digestion avec la deuxième enzyme (BamHI) qui ainsi aurait un support convenable, et la première enzyme évidemment pour recréer l'extrémité voulue de l'autre côté. Un schéma aurait été le bienvenue...désolé.  [...] Piwi, technique élégante, petite question. le vecteur avec le MCS modifié, tu l'amplifie en bactérie avant de refaire la digestion par XhoI, ou bien tu enchaines les différentes étapes, car si tu amplifies en bactérie, comment fais tu pour discréminer un clone avec un MCS modifié d'un clone avec le MCS normal La différence de taille après digestion par d'autres enzymes ne me semblant pas vraiment jouable, je pencherai plus sur l'introduction d'un nouveau site de clivage non présent dans le vecteur, ce qui facilitera le screening pour trouver les clones modifiés.  [...]

Problème lors de ligation

J'ai un plasmide pcDNA3 contenant un insert qui est situé entre deux sites de restrictions Xho I, je digère ce plasmide avec l'enzyme Xho I puis je fais migrer dans un gel TAE 1% avant de récupérer mon insert et mon plasmide ouvert ( grâce à un kit wizard).  [...] Je précise que j'ai vérifié qu'il n'y avais pas de conta dans la BSA ou le tampon on l'enzyme en réalisant un digestion sur un autre vecteur ou cela fonctionne.  [...]

[Biochimie] Clonage après purification sur gel

J'ai donc essayé de digéré mon plasmide ainsi que ma k7 de résistance (1 enzyme pour le vecteur mais 2 sites différents et 3 pour la k7 de resistance). Ce protocole n'a fonctionné qu'une fois. Depuis j'ai toujours des vecteurs ayant échappés à la quadruple digestion.  [...] J'ai testé plusieurs protocoles de digestion du plasmide et de l'insert (de 4h à O/N de digestion). Déphosphorylé ou non pour le vecteur.  [...]

[Biologie Moléculaire] Contrôle négatif clonage

Tu as donc fait une simple digestion de ton vecteur (une seule enzyme de restriction) =. il peut donc se recirculariser tout seul ou avec ligase (voilà qui répond au post de Wobinet).  [...] Pour l'instant, nous n'avons aucun moyen de contrôler que nos colonies aient bien pris le vecteur + l'insert. C'est un tp en plusieurs séances, le tp de lundi prochain a pour but de vérifier le clonage en purifiant les ADN plasmidiques puis on fera des digestions enzymatiques contrôles.  [...]

suggestions sur clonage site de restriction

je voudrais insérer mon insert dans un vecteur pcDNA. une digestion avec 2 enzymes de restriction EcoRI et XbaI a permis d'extraire mon insert contenu dans un vecteur de clonage pGEM et d'autre part de linéariser le pcDNA vide.  [...] sachant que ce n'est pas un problème d'enzyme et que le site de restriction est bien présent car vérifié par séquançage, quelles peuvent être les raisons de ce problème.  [...]

[Biologie Moléculaire] Probleme de clonage avec pT7Blue

une étape de digestion (ouverture) de ton vecteur plasmidique (là où tu as inséré ton produit de PCR) par diverses enzymes de restriction.  [...] ce qui est important à comprendre aussi c'est la coloration, elle est due à un gène lacZ, dans ton plasmide (regarde bien la structure de ton plasmide, donc du vecteur...). ce gène code pour une enzyme qui va couper un prosuit appelé X GAL avec lequel vous avez dû mettre les cellules en culture, sinon c'est pas possible que tu aies obtenu la coloration.  [...]

[Biologie Moléculaire] Plasmide recombinant

Voila j'aimerais comprendre le mécanisme de construction d'un plasmide recombinant, ayant intégré un gène codant pour une protéine.   [...] Si tu veux savoir comment on intègre un insert, c'est simple. digestion enzymatique du vecteur, dephosphorylation ou pas selon les beson, mise en présence du plasmide et de l'insert, ligation, transfection.  [...]