• Santé - Design, Amorces, Sonde

[Biologie Moléculaire] RT PCR plusieurs transcrits, un seul couple d'amorces?

Je te suggère de travailler avec la séquence du gène codant pour la protéine, tu prends la séquence nucléotidique alors, c'est mieux que de travailler avec une séquence protéique. si tu as plusieurs plusieurs séquences nucléotidiques du gène codant pour ta protéine, l'idéal est de faire un alignement multiple de ces séquences, et ressortir une séquence consensus (la région 100% identique), à partir de cette nouvelle séquence, tu pourra faire ton design d'amorces.  [...] Du coup il faut que tu aligne tous les transcrits et que tu design tes amorces et ta sonde (si c'est en Taqman) à partir de la séquence consensus.  [...]

[Biologie Moléculaire] primer dimer

La formation de dimères est due à des conditions de PCR trop permissives, après évidemment un design d'amorces non optimum. Les paramètres que l'on peut modifier sur un qPCR pour diminuer les dimères sont la température d'hybridation (la diminuer), puis la concentration en MgCl2 (la diminuer), et évaluer le ratio sonde/amorces en concentration.  [...] Si tous ces essais ne changent rien et que la présence de dimère reste dommageable pour la PCR (car un dimère en Sybr Green, ça se voit souvent, mais en TaqMan, beaucoup moins) avec une éventuelle inhibition ou limitation de la réaction de PCR par la réaction parasite, alors il faudra repenser le système d'amorces et repartir sur un nouveau design.  [...]

optimisation pcr quantitative temps réel

je cherche à optimiser la détection d'OGM par PCR quantitative en temps réel en condition multiplexe sur un rotorgene. je voudrais savoir qu'est ce que je pourrais ajouter dans mon mix pour augmenter la spécificité de mes amorces sachant que j'ai déjà optimiser les concentrations en amorces, en sondes, en MgCl2 et que j'ajoute de la BSA.  [...] Je suis assez étonné que tu veuilles augmenter la spécificité de la réaction. il me semble qu'en faisant un bon design des amorces et si en plus tu utilises une sonde, ça devrait être satisfaisant.  [...]

[Biologie Moléculaire] Question sur le design de sondes Taqman pour la PCR en temps réel

Lors du design de sondes Taqman avec un quencher BHQ, on part du principe que le Tm de la sonde doit être de 7-10°C de plus que celui des amorces, afin de s'assurer la spécificité de l'hybridation de la sonde.  [...] Quel est le risque d'utiliser une sonde Taqman BHQ dont le Tm est le même que celui des amorces Peut-il y avoir de l'amplification non spécifique de la cible pour laquelle le modèle a été designé La limite de détection du modèle peut-elle être modifiée.  [...]

[Biologie Moléculaire] Design de sonde Taqman à partir d'une sonde FISH

Je voudrais savoir s'il est possible d'utiliser une sonde FISH (ciblant le 16S de bacteroides) comme sonde Taqman pour la quantification de la bactérie, si oui, comment on fait s'il vous plait Mon superviseur me demande d'utiliser la même séquence de la FISH (déjà publiée) pour la RT-PCR, mais aussi de designer des amorces de part et d'autre de cette séquence pour 1 PCR classique.  [...] Ma suggestion était de prendre la séquence de la sonde FISH, faire des blast et ressortir les séquences des régions 16S des bacteroides ssp., faire des alignements de séquences et ressortir une séquence consensus. A partir de cette séquence consensus, je pourrai designer la sonde Taqman et les amorces, mais il ne veut pas cette suggestion.  [...]

Help please ! Design d'amorces pour l'insertion de 3 nt

Une des deux amorce correspond tout simplement à la séquence formée par les 15 premiers Nt. L'autre amorce correspond aux 15 Nt complémentaire des 15 derniers Nt de ta séquence à amplifier.  [...] C'est tout bête, il suffit d'appliquer le principe que j'ai énoncé précédemment, en fait. A savoir. Une des deux amorce correspond tout simplement à la séquence formée par les 15 premiers Nt. L'autre amorce correspond aux 15 Nt complémentaires des 15 derniers Nt de ta séquence à amplifier.  [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage orienté, design d'amorces

3) En introduisant les sites de restrictions dans mes amorces, cela peut engendrer un décalage du cadre de lecture... Comment le vérifier (j'ai essayé des logiciels comme Geneious & Co... mais ne maitrisant pas ces logiciels j'ai perdu plus de temps qu'autre chose ).  [...] Moi je fais jamais de sous clonage, je clone direct dans le plasmique d'intérêt. Il suffit de dessiner tes amorces en conséquence.  [...]

Amorce RT-qPCR exon exon

Je suis complètement perdu par rapport design, on me dit que pour éviter d'amplifier de l'ADNg je dois utiliser des amorces exon-exon et qu'il y a différente stratégie de design.  [...] 3. que tes deux amorces soient sur des exons différents, avec un ou plusieurs introns de bonne taille entre les deux, ce qui fait que le temps d'élongation dans ton cycle de PCR ne permettra pas d'amplifier la séquence génomique, trop longue.  [...]

[Biologie Moléculaire] Hybridation in situ

je suis en thèse et je dois réaliser une ISH or je n'en ai jamais fait de ma vie. j'ai récupéré des protocoles mais je voudrais savoir comment faire le design des amorces pour mon gène avec T3 et T7 HELPPPPPPPPP.  [...] Les amorces c'est pour designer la sonde que l'on va insérer dans un vecteur qu'il faudra ensuite linéariser par restriction selon l'orientation et transcrire (souvent avec la T3,la T7 ou la SP6 polymérase) pour obtenir de l'ARN.  [...]

[Biologie Moléculaire] Comment design des amorces PCR..

Bah oui justement le site de restriction je dois le mettre au début de mes amorces pour pouvoir l'insérer ensuite dans le plasmide de la bactérie digérée par BamH1 et Sma1. Mais je sais pas s'il faut compter les nucléotides (qui font donc partie de l'amorce.  [...] oui oui oui tu dois bien les mettre en 5' de tes amorces. C'est pour ça que je te propose de faire une PCR en 2 cycles, le premier cycle avec seulement la partie qui bind 100% va te permettre de créer quelques amplicons avec ton site et ensuite tu prends le Ta de ton full primer pour faire le 2ème cycle.  [...]