• Santé - Contrôle, Protéine, Intérêt

[Biochimie] Normalisation de la quantité de protéine Western Blot

Et bien tu utilises un anticorps dirigée contre ta protéine de normalisation comme l'actine, la tubuline, le GAPDH... pour révéler sur la même membrane où tu as révélé ta protéine d'interêt. Si tu as déposé la même quantité de protéine dans les puits, ta protéine contrôle va te permettre de le confirmer visuellement.  [...] Même si le western n'est pas une méthode quantitative il est aussi possible de mesurer l'intensité de tes bandes avec un logiciel, et de normaliser ta prot d'interêt par rapport à ta protéine contrôle mais en général on se contente du visuel.  [...]

[Biologie Cellulaire] Notion de contrôles, contrôles isotypiques, culture cellulaire

Pour moi, il s'agit d'un contrôle permettant la vérification de l'absence de fixation non spécifique d'un anticorps, que l'on effectue en incubant une IgG dirigée contre une protéine jamais exprimée dans la cellule qui nous intéresse. Ainsi, on vérifie l'absence de fixation non spécifique et donc la spécificité du marquage effectué avec l'anticorps dirigé contre la protéine que l'on veut localiser.  [...] Bah si l'anticorps qui cible votre protéine d'intérêt est un IgM, l'anticorps contrôle doit être un IgM. Si il s'agit d'un IgG, le contrôle doit être un IgG.  [...]

[Biochimie] Problème avec mon western

un pour la protéine d'intérêt, un pour le témoin de dépôt (actine dans ton cas). Bien entendu, cela n'est pas optimal pour la normalisation par le témoin de dépôt, mais si le dépôt est bien homogène entre les deux gels et que le volume est déposé avec précision, c'est valable.  [...] Ce que je fais maintenant c'est un mix de mes 2 Ac primaire. Comme ca, les conditions sont scrupuleusements identiques entre mon controle et ma proteine d'interet. Si les tailles sont trop proches... changer de controle interne.  [...]

[Immunologie] Fixation pour immonofluorescence

Par contre ils restent visibles dans les cellules transfectées avec les plasmides contenant mes gènes d'intérets. J'ai peur que les méthodes de fixations utilisées n'entrainent une relocalisation cellulaire de mes protéines.  [...] Le plasmide vide signifie qu'il n'y a que la GFP. Donc la GFP est exprimée seule, pas en fusion avec la protéine d'intérêt. Cela fournit un contrôle indispensable pour montrer que les conditions utilisées n'affecte pas la localisation de la GFP, et donc prouver qu'une relocalisation éventuelle de la protéine de fusion GFP-X est spécifique de la protéine X.  [...]

hybridation in situ vs rapporteur

Pour étudier la localisation de l'expression d'un gène (à l'échelle cellulaire, pas subcellulaire), quel est l'intérêt de l'hybridation in situ par rapport à l'utilisation d'un rapporteur sous contrôle du promoteur de ce gène (ou l'intérêt de cette dernière technique par rapport à la 1ere).  [...] Ca depend comment est realisee la fusion, il est possible de faire une fusion traductionnelle du gene rapporteur avec la proteine d'interet afin de detecter la localisation de celle ci. Dans ce cas, il est recommande de transformer une telle construction dans un mutant pour le gene d'interet afin de voir si la proteine de fuision complemente le phenotype (un tres bon controle).  [...]

[Biologie Moléculaire] Vecteurs d'expression

l'intérêt de mettre le fragment d'ADN dans le même sens qu'un promoteur est très certainement de permettre une transcription/traduction dans le cas ou l'on souhaite produire une protéine.  [...] D'après ce que j'ai compris de ton propos, l'ADN cloné en orientation inverse serait un contrôle négatif, car le vecteur correspondant ne permettrait pas l'expression de la protéine d'intérêt (en faisant que l'hypothèse que ton fragment d'ADN initial contienne une phase ouverte de lecture, un codon stop, etc.  [...]

[Biologie Moléculaire] normalisation western blot après fractionnement cellulaire

Je fais un fractionnement cellulaire et j'obtiens la fraction cytosolique, membranaire, nucléaire et cytosquelettique. Ensuite je fais un western blot pour ma protéine d'intérêt dans chacune de ces fractions mais pour pouvoir la quantifier, je cherche une protéine contrôle pour normaliser mes résultats dans les fractions cytosoliques et membranaires en premier lieu.  [...] Quelle protéine peut être assez fiable à utiliser comme contrôle dans chacune de ces fractions.  [...]

[Biologie Cellulaire] traitements cellulaire à l'aide d'inhibiteur pharmaco: Peut-on remplacer le DMSO?

Or, ces molécules sont souvent administrées en prétraitement d'un activateur tel qu'EGF ou E2. Le problème c'es que l'effet activateur n'est plus observable sous la condition contrôle qui a tout de même été traité avec du DMSO sans inhibiteur (ce qui n'est pas le cas en absence de DMSO, je vois bien une activation de ma protéine d'intérêt avec traitement seul EGF ou E2).  [...] Bref, j'ai de bonne raison de croire que le DMSO y est pour quelque chose et j'aimerais savoir s'il était possible de le remplacer par un autre solvant comme le DMF...enfin j'aimerais aussi savoir en quoi le DMSO est préférable au DMF pour certains composés, il me semble que les deux solvants partage la plupart des propriétés lipophiles. Je me trompe.   [...]

Schémas d'activation de la protéine Kinase C | Dossier

Un ligand ( hormone, peptide ou neurotransmetteur...) se fixe sur un récepteur formé de 7 hélices transmembranaires. une boucle intracellulaire permet la stimulation de la protéine G. L'activation de cette protéine entraîne la formation d'un complexe protéique permettant un contrôle de la cellule sur la durée de cette activation, les compartiments cellulaires visés ainsi que le type de signal à transmettre à l'intérieur de la cellule (Zuker C.S., Ranganthan R., 1999).  [...] L'activation de la phospholipase D peut également se faire par la formation d'un complexe constitué d'un récepteur à protéine G couplé à une petite protéine G de type Rho ou ARF, échappant ainsi au contrôle classique par l'intermédiaire d'une protéine G hétéro-trimérique (Okamoto T. et al., 1998).  [...]

[Immunologie] Anticorps relevant

dans un contrôle négatif, on utilise plutôt une anticorps irrelevant (c'est à dire qui ne reconnait rien qui a un intérêt pour toi on pourrait le traduire par non pertinent), en immunomarquage on utilise plutot le terme de contrôle isotypique. ex si tu veux révéler une protéine X, et tu utilises un marquage direct avec un anticorps IgG1 de souris anti-X couplé FITC, tu utilises en contrôle une IgG1 de souris irrelevante-FITC (qui ne reconnait rien dans ton système, ces molécules sont vendues sous le nom de contrôles isotypiques).  [...] oui à ce moment là l'anticorps contre la protéine d'intéret est l'anticorps relevant. mais enfin c'est un peu bizzare comme langage.  [...]