• Santé - Construction, Plasmide, Digestion

Sens de lecture d'un plasmide

Je tente de faire une construction à l'aide d'un programme et j'ai trouvé la séquence de mon plasmide. J'ai repéré les sites de restriction à utiliser qui seront de part et d'autre de mon gène.  [...] Seulement je me pose la question de l'orientation de mon gène. Tout d'abord comment savoir où se trouve le 5' et où se trouve le 3' du plasmide J'ai une séquence qui est numérotée de 1 à 5369. Le 5' commence toujours en 1.  [...]

[Biotechnologie] Construction plasmidique

Oui dans un monde parfait le protocole pourrait se résumer à cela. Patience, persévérance et sang-froid sont de rigueur pour une construction plasmidique.  [...] Ensuite digestion des amplifiats obtenues par des enzymes encadrant le gène, et correspondant à là où tu veux le mettre dans ton nouveau plasmide, afin de le récupérer. Par contre si par construction plasmidique tu entend, logiquement, construire un plasmide entier, alors là lors de l'amplification des parties géniques sur des plasmides de stockage, les primers que tu utilise doivent posséder une partie liant le template et une partie non liant appelée overlap, d'au moins 40bp.  [...]

[Biologie Moléculaire] primer with (too!!!) long tail?

Après extraction des plasmides et digestion ma construction semble être la bonne.  [...] Il faut encore que je valide par séquençage. Je dois avouer aussi que dans mon cas c'est assez simple vu que dans les 30nt que j'avais à insérer il y a un site de restriction, j'ai donc pu valider mes constructions en digérant par cette enzyme.  [...]

[Biologie Moléculaire] Protocole pour une ligature + tranformation ?

Voilà, je continue gaiement mon stage à Barcelone, mais maintenant j'ai un petit souci. je dois faire une construction plasmidique toute simple, donc digestion de l'insert et du vecteur par 2 enzymes de restriction, ligature, et puis transformation de bactéries E. coli.  [...] Non, je ne vais pas transformer Agro avec une construction pBSK, mais avec une autre construction sur le plasmide T qui contiendra le fragment que j'aurai amplifié sur E. coli. Ce plasmide servira ensuite à transformer mes plants.  [...]

Probleme d'induction de GST dans bacterie

3. Pour mieux cerner ton problème, tu commences par répéter ton protocole de production en utilisant le vecteur vide au lieu de ta construction. La GST est une protéine très facile à produire donc tu en auras des tonnes si ton protocole est correct. Rend toi au 4 si tu as beaucoup de GST, sinon rend toi au 7.  [...] Persso la première chose que je ferais c'est transfo, selection, culture overnight et miniprep de plasmide. Après digestion par restriction et tu sort la GST ou ton insert. Et là t'es sur que la construction est bonne déjà ça me semble essentielle.  [...]

Intégration dans un plasmide

Non, c'est pas systematique. Ca depend de la qualité de tes digestions, de la taille de ton vecteur et de ton insert. Par contre, ce genre de construction se fait in vitro. Tu transformes ensuite la bacterie par ton plasmide. Pour integrer un fragment d'ADN dans un plasmide deja dans une cellule, je dirais que tu ne peux le faire que par recombinaison homologue, mais c'est bcp plus compliqué et j'ai jamais entendu d'une telle manip pour modiifier des plamisdes.  [...] Donc on fabrique un plasmide recombinant in vitro (en y introduisant le gène voulu) et on transforme les bactéries avec cette construction.  [...]

Technique Gateway

alors qu'en général la construction de chaque plasmide séparément prend entre 2 jours et... une éternité. (= il y a des plasmides qu'on n'arrive jamais à obtenir).  [...] On passe d'abord par une première recombinaison en plasmide donneur et on obtient un clone d'entrée. Tu va pouvoir multiplier ce plasmide et en stocker une grosse partie, afin de réaliser d'autres clonages ultérieurs, dans des tas de vecteurs de destination différents. D'où l'intérêt de cette étape supplémentaire.  [...]

[Biologie Moléculaire] Clonage

Je commence actuellement une construction pour generer un nouveau modele de souris transgenique. J'en suis seulement a la construction du vecteur et je me pose la question suivante. Je dois effectuer un clonage d'un fragment d'environ 700pb dans un plasmide au niveau d'un site EcoRI.  [...] Dés lors, les quantités d'inserts ne sont plus très importantes si votre digestion est totale (à contrôler en transformant avec le plasmide ouvert sans ligation). En général ce que je fais c'est une photo avec un aliquote du plasmide et de l'insert et j'évalue les quantités à utiliser pour avoir autant de l'un que de l'autre.  [...]

[Biologie Moléculaire] Expression de protéines grâce au pGEX. DH5alpha ou BL21?

Pour l'instant j'amplifie mon plasmide dans une souche de Coli DH5alpha. Instinctivement (après mes aventures dans le monde de la production en pET) j'allais passer sur une souche BL21 peu pratique à utiliser. Puis réflechissant un peu je me suis rendu compte que finalement la souche BL21 n'a surtout d'intérêt pour la production de protéines en pET que parce qu'elle permet l'utilisation du promoteur T7 du plasmide.  [...] Je n'ai jamais produit de proteine de fusion. J'avais besoin d'une construction et au lieu de recevoir un simple plasmide, j'ai recu une construction dans un pGEX. Je suppose que c'est pour produire ma prot en fusion avec les GST.  [...]

[Biologie Moléculaire] Mutagenèse: Pb...

C'est bien joli d'avoir des idées fixes sur les protocoles mais selon le matériel à disposition, chaque protocole nécessite des optimisations qui vont l'adapter au matériel. Pour mes transformations chez E. coli BL21(DE3) il me fallait 100 ng de plasmide issu de la ligation pour avoir un nombre de colonies transformées correct.  [...] Pr ce qui est des c. E. coli BL21(DE3), il vs fallait 100 ng de plasmide, car ce type de cellule est utilisé pr la production de protéines recombinantes. Le taux (%) de transformation de ces c. est plus faible que celui des DH5 alpha, utilisées le 3/4 pr un clonage (et parfois même pr une production).  [...]